冻融卵母细胞显微受精后冻融胚胎移植成功妊娠一例华



冻融卵母细胞显微受精后冻融胚胎移植成功妊娠一例华

徐清华，张敏，常秀峰，李冬秀，包莉莉，许鹏宇，于晓惠，吴小

[作者单位]050082 石家庄，解放军白求恩国际和平医院生殖医学中心

[关键词]低温保存；卵母细胞；胚胎移植；妊娠

随着辅助生殖技术发展，卵子冷冻应被视为辅助生殖技术重要的组成部分[1]。2013年美国生育年会颁布的指导原则表明，目前成熟卵子的冷冻已不再局限于实验研究[2]。解放军白求恩国际和平医院生殖医学中心采用玻璃化冷冻胚胎取得了满意的种植率和妊娠率。2014年该中心采用玻璃化冷冻经历了冻卵、冻胚的双冻试管婴儿1例，获得临床妊娠，现报告如下。

1资料与方法

1.1临床资料女，23岁。主因婚后1年不孕于2014年1月17日就诊。患者月经规律，性生活正常，未避孕，同居1年未孕。女方B超监测有排卵，未行输卵管检查。男方精液常规分析结果：密度2.77×106/ml，d级(不活动)精子：100%。男方口服中药数月，期间服用氯米芬+左卡尼丁2个月，经治疗后精液分析结果：密度8.61×106/ml，a级0，b级0.83%，c级1.65%。双方否认肝炎、结核及性病史，染色体检查均正常。诊断：原发不孕、重度少弱精子症。拟行卵胞浆内单精子注射技术(ICSI)助孕。女方用达英-35预处理1个月，采用促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)长方案降调，用促卵泡激素(FSH)联合人绒毛膜促性腺激素(HCG)促排卵。2014年2月28日取得卵子33枚，成熟卵母细胞(MⅡ)29枚，取卵当天只找到男方3条活精子用于ICSI注射，其中2枚卵子异常受精，1枚卵子第3天卵裂2个细胞，未移植。其余卵子均冷冻。

1.2卵子冻融及复苏方法采用玻璃化冷冻，主要试剂为乙二醇、二甲基亚砜和蔗糖，平衡液浓度7.5%乙二醇+7.5%二甲基亚砜，冷冻液浓度15%乙二醇+15%二甲基亚砜+0.5 mol/L蔗糖，4℃保存。使用前取出放置室温。将卵子放入平衡液中，时间≤5 min，取出卵子放入冷冻液中，25～60 s将卵子转移到冷冻环迅速放入液氮。卵子复苏液主要为蔗糖，复苏液1、2、3浓度分别为1.00、0.50、0.25 mol/L，4℃保存。使用前在37℃平衡，卵子从液氮中取出迅速放置复苏液1中，放置时间为1 min，然后转入复苏液2中5 min，在复苏液3中洗涤，最后放入体外培养液中。

1.3胚胎冻融及移植方法2014年8月19日解冻卵子9枚，其中8枚MⅡ，1枚死亡，复苏率为88.9%。男方当天留取精液，找到8条活精子行ICSI注射，受精率为100.0%，双原核(2PN)率为87.5%，多核1枚。第3天卵裂率为100.0%，有5枚可利用胚胎，因女方身体突然不适取消移植，将5枚胚胎全部冷冻，其余2枚继续培养，第5天退化丢弃。2014年9月13日行冻融胚胎复苏移植2枚，胚胎分别为8细胞2级(8C2)和12细胞3级(12C3)。

2结果

本例冻融胚胎复苏移植后14 d，血HCG 1270 mU/ml，黄体酮28 ng/ml，雌二醇(E2)408 pg/ml，取得生化妊娠。移植30 d行B超监测宫内可见27 mm×15 mm孕囊，内见胎芽、卵黄囊及原始心血管搏动(图1)，目前胎儿宫内发育正常。

图1冻融胚胎复苏移植30 d B超影像

3讨论

在冷冻技术中，冻精、冻胚胎技术在生殖领域已相当成熟，但是冻融人卵细胞一直是生殖技术的一项难关。自1986年首次报道人卵子冷冻-复苏并成功受孕以来[3]，卵子冷冻技术进展较为缓慢，主要由于人卵母细胞是体内最大的细胞，内含大量水分，加之体表比例大和胞膜渗透性等特性，在低温冷冻、复温过程中容易形成冰晶，导致纺锤体受损造成细胞致命的损伤[4-5],因此选择合适的冷冻方法减少冰晶形成至关重要。

近年来，玻璃化冷冻是一种新兴的冷冻技术,该技术操作简单，不需要昂贵的冷冻仪器，而且很好地解决了冷冻、复温时冰晶造成的损伤，是目前胚胎冷冻最有效的方法[6-7]。其基本原理是利用高浓度的渗透性冷冻保护剂(如乙二醇、二甲基亚砜、聚乙二醇等)和非渗透性保护剂蔗糖，经急速降温使脱水后样本残留的水分由液态转化为类似玻璃的非晶体化状态，在-196℃的低温环境中将细胞或组织固定在玻璃化状态，保留了细胞内外液体正常的分子和离子分布，避免产生冷冻损伤[8]。Trokoudes等[9]用玻璃化冷冻保存的卵子供卵，卵子复苏率为91.4%，新鲜卵子和冷冻卵子受精率分别为86.6%和84.4%，卵裂率分别为95.8%和95.1%，高质量胚胎率分别为64.9%和60.4%，种植率分别为24.7%和25.6%，活产率分别为47.2%和41.5%，两者之间无明显差异，提示冷冻卵子可以得到与新鲜卵子一样质量的胚胎、妊娠率和种植率。Solé等[10]报道玻璃化冷冻卵子供卵复苏率为85.6%，新鲜卵子和冷冻卵子受精率分别为80.7%和78.2%，妊娠率分别为71.0%和68.2%，高质量胚胎率分别为54.1%和49.8%，多胎妊娠率分别为27.7%和20.8%，活产率分别为38.4%和43.4%。Trokoudes等[9]和Solé等[10]的研究结果一致，认为玻璃化冷冻是保存卵子的一个有效方法。

本例采用玻璃化冷冻卵子复苏率为88.9%，受精率为100.0%，卵裂率为100.0%，达到与新鲜卵子一致的效果。Levi Setti等[11]报道了世界首例冷冻精子、冷冻卵子和冷冻胚胎的“三冻”试管婴儿诞生。2006年国内首例“三冻”试管婴儿诞生[12]。继2014年倪丰等[13]报道的1例冻卵冻胚试管婴儿诞生后，本例冻卵、冻胚试管婴儿成功临床妊娠，这些病例为MⅡ和胚胎多次冷冻提供了临床资料和经验，为年轻女性保存生育能力以及建立卵子库奠定了坚实的基础。

[参考文献]

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[2]Practice Committees of American Society for Reproductive Medicine， Society for Assisted Reproductive Technology. Mature oocyte cryopreservation: a guideline[J].Fertil Steril， 2013，99(1):37-43.

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[10]Solé M, Santaló J, Boada M,etal. How does vitrification affect oocyte viability in oocyte donation cycles? A prospective study to compare outcomes achieved with fresh versus vitrified sibling oocytes[J].Hum Reprod, 2013,28(8):2087-2092.

[11]Levi Setti P E, Albani E, Novara P V,etal. Normal birth after transfer of cryopreserved human embryos generated by microinjection of cryopreserved testicular spermatozoa into cryopreserved human oocytes[J].Fertil Steril, 2005,83(4):1041.

[12]陈贵安,蔡学泳,廉颖,等.玻璃化冷冻成熟卵母细胞经解冻精液单精子注射受精并胚胎冻融及移植妊娠成功[J].中华妇产科杂志,2006,41(4):217-218.

[13]倪丰,汪存利,姜宏,等.冻融卵母细胞显微授精后冻融胚胎移植成功并分娩一例报道[J].生殖医学杂志,2014,23(8):676-678.

(收稿时间：2015-02-28修回时间：2015-03-18)

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.05.006

[文献标志码][中国图书资料分类号]R711.6B

[文章编号]2095-140X(2015)05-0021-02

[通讯作者]吴小华,E-mail：xiaohuawu65@sohu.com

[基金项目]河北省计划生育委员会科研基金项目(2012-C02)