促卵泡激素和血管内皮生长因子在大鼠卵巢组织冷冻自体异位移植中的保护作用

李冬秀，耿杨柳，吴小华，张　敏，徐清华，于晓惠，许鹏宇



促卵泡激素和血管内皮生长因子在大鼠卵巢组织冷冻自体异位移植中的保护作用

李冬秀，耿杨柳，吴小华，张敏，徐清华，于晓惠，许鹏宇

[摘要]目的探讨促卵泡激素(FSH)和血管内皮生长因子(VEGF)在大鼠卵巢组织冷冻自体异位移植后对卵泡内分泌功能的影响。方法Wistar大鼠30只随机分为A、B、C组，每组10只，A组为新鲜卵巢组织移植，B组和C组卵巢组织均直接覆盖玻璃化冷冻保存2周复苏后移植，但C组在移植前2 d肌内注射FSH和VEGF，连续用药5 d。移植6周后计算卵泡密度；检测大鼠血清中雌二醇(E2)水平；卵巢组织增殖细胞核抗原(PCNA)的表达情况，并测定子宫重量。结果A、B、C组移植后卵巢组织存活率比较差异无统计学意义(P>0.05)。A、C组卵泡密度、血清E2水平、PCNA阳性率和子宫重量均高于B组(P<0.05)，A组和C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论大鼠卵巢组织冷冻复苏自体异位移植前注射FSH和VEGF可以有效提高卵泡存活率，有利于恢复卵巢内分泌功能。

[关键词]卵泡刺激素；血管内皮生长因子类；卵巢；低温保存；移植,自体；大鼠,Wistar

卵巢组织冷冻移植作为非常有希望同时解决保存女性生育力和内分泌功能的方法，从Okay等[1]第一次尝试用冷冻的卵巢组织移植后得到胚胎，到2004年Donnez等[2]报道了世界第一例卵巢组织冷冻移植婴儿的问世，给了需要卵巢组织冷冻保存的女性很大的期待，也给了医务工作者们莫大的鼓舞，这一研究课题也成了生殖领域、肿瘤学科等关注的热点。但是，由于卵巢组织细胞类型复杂，间质细胞多，含有人体最大的细胞(卵母细胞)，在冷冻和复苏过程中容易发生副损伤，为了更大化保存其中的卵泡及细胞，在近20年围绕卵巢组织冷冻方案开展的研究众多，从最初的慢速程序化冷冻到玻璃化冷冻，再到Chen等[3]报道的直接覆盖玻璃化冷冻(direct cover vitrification， DCV)方法，从冷冻保护剂浓度到各种载体的探索，卵巢组织冷冻的损伤已经明显降低，卵泡保存相对提高。但是，目前卵巢组织复苏后移植尚有许多问题未得到解决，如何提高移植物的存活率及最大程度恢复移植物功能的研究相对较少。本研究采用冷冻大鼠卵巢组织自体异位移植前肌内注射促卵泡激素(FSH)和血管内皮生长因子(VEGF)，观察其对于移植物存活和卵泡发育的影响，以期为提高卵巢组织冷冻移植的存活率提供理论依据。

1材料与方法

1.1实验动物与分组成熟雌性Wistar大鼠30只，8～10周龄，体重200～220 g，购自河北医科大学动物研究中心。随机分为A、B、C组，每组10只。A组(新鲜卵巢组织移植)：手术摘除双侧卵巢组织后将新鲜卵巢皮质进行自体异位移植；B组：手术摘除双侧卵巢组织，采用DCV方法冷冻卵巢组织，冷冻保存2周后复苏，进行自体异位移植；C组：方法同B组，只是在移植前2 d开始肌内注射FSH 5 mU/d，VEGF 20 ng/d，连续用药5 d。本研究经解放军白求恩国际和平医院伦理委员会批准,于该院动物实验中心进行，该中心达到SPF条件。对动物处置符合科学技术部2006年《关于善待实验动物的指导性意见》的要求。

1.2卵巢组织标本取材给予1%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉，常规消毒、开腹，手术切除双侧完整卵巢。用生理盐水反复冲洗卵巢组织至少3遍，至表面清洁，将卵巢皮质切成体积2 mm×2 mm×4 mm的小块，备用。术后对大鼠手术切口进行聚维酮碘消毒，肌内注射青霉素，2/d，连续用药7 d。

1.3DCVDCV过程参考Chen等[3]的方法，所有操作均在室温下进行，将卵巢组织块浸入平衡液[7.5%乙二醇(v/v)+7.5%二甲基亚砜(v/v)+0.5 mol/L蔗糖+DPBS]中，渗透平衡15 min，再移入冷冻液[15%乙二醇(v/v)+15%二甲基亚砜(v/v)+0.5 mol/L蔗糖+DPBS]中，渗透平衡5 min。轻柔夹取卵巢皮质，置于1.8 ml的无菌冷冻管中，将冷冻管用清洁液氮充满，密封冷冻管，投入贮存液氮罐中备用。

1.4复苏过程2周后从液氮罐中取出冷冻管，37℃水浴中解冻30 s，将卵巢组织块依次移入含0.5、0.25、0.125 mol/L蔗糖+基础液的解冻液中，每个浓度各停留5 min，再用含20%胎牛血清的DMEM冲洗卵巢组织2次。

1.5自体异位移植于大鼠左侧后肢做一长0.8 cm的纵切口，将新鲜或冻融卵巢组织块移植于肌肉中，常规缝合，术后对手术切口进行聚维酮碘消毒，肌内注射青霉素，2/d，连续用药7 d。

1.6移植后大鼠情况及移植物的取出卵巢组织移植后3 d开始每日行阴道涂片，显微镜下观察脱落细胞类型，出现动情周期的大鼠依据阴道上皮类型进行判定，未出现动情周期的大鼠观察角化细胞，角化细胞比例>50%则认为有雌激素样效应。断头法处死大鼠，取血测定血清中雌二醇(E2)水平，手术剥除移植物备用，同时手术摘除大鼠子宫，称重子宫重量。

1.7观察指标

1.7.1阴道脱落细胞学观察：固定器固定大鼠后，取生理盐水0.1～0.2 ml注入大鼠阴道，轻轻吹打，使阴道脱落细胞融入生理盐水，将吹打后的生理盐水涂至玻片上，自然干燥，HE染色后光镜下观察。判断标准：动情前期，以椭圆形有核上皮细胞为主，偶有少量角化细胞和白细胞；动情期，无核角化细胞呈片状为主，偶有少量上皮细胞和白细胞；动情后期，白细胞、片状角化细胞、有核上皮细胞并存，三者数目相当；动情间期，大量白细胞及少量有核上皮和角化上皮细胞。

1.7.2血清E2水平测定：用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定大鼠血清E2水平，根据阴道脱落细胞学结果，在动情期留取血清，测定E2水平。

1.7.3卵泡密度：观察卵巢组织结构及卵泡的形态及密度。随机选取5个视野，在100倍视野下，用5 mm×5 mm网格微尺计数，计算每平方毫米内卵泡的数量，即卵泡密度。

1.7.4增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)表达情况：阳性细胞定位于卵母细胞及颗粒细胞核，呈棕黄色。卵母细胞核及>50%的颗粒细胞出现棕色时，视为PCNA表达阳性。计算PCNA蛋白表达率，PCNA阳性卵泡率=(PCNA阳性卵泡个数/卵泡总个数)×100%。

1.7.5子宫重量测量：于处死大鼠当日手术摘除子宫，去除周围系膜及组织称重。

2结果

2.1移植物存活情况移植6周后取出移植物观察，卵巢组织均清晰可见，表面红润，生长呈球形或椭圆球形，周围可见血管供应，与周围组织间可见丰富毛细血管，偶有斑点状纤维化区域，为移植成功。移植物呈纤维化状态，黄白色，与周围组织血供不明显、质地偏硬者判定为移植失败。A组1例、B组3例、C组2例移植失败，差异无统计学意义(P>0.05)。对于移植失败者，则不再进行血清E2测定、卵泡密度计数及PCNA检测，也不再进行子宫重量测量。

2.2卵泡密度A、B、C组卵巢组织中卵泡的密度分别为(5.17±0.47)、(2.07±0.28)和(5.05±0.31)个/mm3。A、C组卵泡密度高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)，A组与C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3血清E2水平A、B、C组血清E2水平分别为(59.61±6.85)、(28.38±8.47)、(58.99±8.63)ng/L。A、C组血清E2水平高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)，A组和C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4PCNA表达情况A、B、C组卵泡PCNA阳性表达率分别为(76.24±2.59)%、(40.7±2.86)%、(73.93±4.33)%。A、C组PCNA阳性表达率均高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)，A组和C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5子宫重量A、B、C组子宫重量分别为(1.39±0.09)、(1.10±0.12)和(1.36±0.10)g。A、C组子宫重量高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)，A组与C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3讨论

近年来，卵巢组织冷冻和卵巢移植取得了一些进步，迄今已有20余例婴儿通过自体移植冷冻卵巢组织出生[4-5]。但是，移植最初几天卵泡的丢失明显限制了这一领域的发展[6-7]。卵巢组织冷冻损伤过程可能会损失一部分卵泡，在移植后由于缺血、缺氧对卵泡损失的影响更明显，如何使卵巢移植物度过缺血、缺氧的敏感期，尽量减少由于微循环缺失而导致的移植失败，也是研究的重点之一，已经有学者进行了一些有益的探索，但是，在移植过程中如何减少卵泡损失的研究尚少，学者们还未达成共识。

为了尽可能完整保存卵泡、提高移植成功率，学者们从卵巢组织冷冻方案、移植部位、移植时的处理等多方面进行了探索。人类自体移植卵巢组织可以进行原位移植，也可以异位移植到前臂皮下、腹壁等部位。在动物实验中，为了提高移植成功率，选择血液供应丰富的部位进行移植是大家的共识，肾被膜下、腹膜内、肌肉组织等都是容易移植成功的部位。本研究采用的移植部位为大鼠后肢大腿肌肉，这个部位与肾被膜下相比，血液循环稍差，但是Abir等[8]认为这样更能模拟卵巢真正生长的盆腔环境，而且前期部分学者的研究也发现，肌肉组织血管重建的效果优于皮下组织，卵巢移植存活率也很高[9]。有研究将移植到卵巢窝、皮下、腹膜与肌肉中的人卵巢组织进行比较，移植到肌肉中的卵巢组织间质纤维化程度明显低于其他部位移植组[10]。本研究也证实大鼠后肢肌肉组织也是理想的卵巢组织异位移植部位。

玻璃化冷冻方法对卵巢组织中各级卵泡的保存效率比较高。文献报道冷冻过程丢失卵泡率为7%，而移植后到血管形成前可能有2/3的卵泡丢失，提示原始卵泡的丢失主要集中在移植过程[11-12]。小块卵巢组织的移植没有血管吻合，移植后血供完全依靠周围组织间的毛细血管，移植后48 h组织缺氧最严重，所以，移植过程卵泡丢失的多少直接决定了移植的成败。作为发挥卵巢功能的最基本单位，原始卵泡存留的数量直接决定了移植后卵巢组织功能的持续时间。目前报道的卵巢组织移植后功能维持时间从几个月到7年不等[13-16]。对于卵巢移植后卵巢功能维持时间短的患者，只能依靠再次卵巢移植来保证生活质量。减少移植时卵泡的损耗，从患者长期生存需要来说，可以减少移植的次数，节约医疗资源和经济成本。

为了最大限度保留移植后卵泡的功能，许多学者做了大量工作，主要为促进毛细血管形成和减少缺氧损伤两方面。促进移植后毛细血管的形成，尽快建立移植卵巢与周围组织间血运，为移植物提供足够丰富的血供和氧供，有利于移植物存活。VEGF是可以促进毛细血管形成的因子，对血管生成具有很强的诱导作用，是目前所知的特异性作用于血管内皮细胞的生长因子，也是唯一明确有促进血管形成的药物[17]。另据报道促性腺激素可调节卵巢内VEGF水平，因此移植前后给予外源性激素可以促进移植后毛细血管形成。研究发现，在移植前后注射促性腺激素释放激素，可使移植卵巢组织中的卵泡数量明显增多，其作用机制可能是通过上调VEGF等来促进血管再生[18]。

本研究结果显示，C组卵泡密度、血清E2水平和子宫重量均高于B组，提示卵巢组织内分泌功能恢复优于B组；PCNA作为卵泡启动生长的最早指标，本研究结果也证实C组卵泡组织中PCNA阳性表达率高于B组。分析原因可能是VEGF和FSH的联合应用促进了移植后卵巢组织与周围肌肉之间更快的毛细血管形成，缩短了缺血、缺氧时间；另外，FSH可能促进了一些卵泡的生长，减少了卵泡丢失，因而更好地保存了卵泡。而Schnorr等[19]的研究认为，在移植前注射VEGF并没有改善移植卵巢组织的活性，分析原因可能与用药时间有关。Imthurn等[18]认为在移植前后2 d用促性腺激素有助于提高卵泡存活率，用药过晚(移植后开始)和用药时间过长都可能导致用药无效,分析原因可能是由于VEGF需要在移植前合成一段时间才能达到一定的作用量，至少可在移植后最容易发生缺血、缺氧的时期发挥作用，以促进毛细血管形成。

综上所述，卵巢组织冷冻移植效果与冷冻技术、移植部位及移植方法等多种因素相关，如何全面提高卵巢组织移植技术，还需要进行更深入、更系统的研究。

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(收稿时间：2015-02-10修回时间：2015-03-15)

·论著·

Protective Effects of FSH and VEGF on Ovarian Tissues Vitrification and Autotransplantation in Rats

LI Dong-xiu, GENG Yang-liu, WU Xiao-hua, ZHANG Min, XU Qing-hua, YU Xiao-hui, XU Peng-yu (Center of Reproductive Medicine Center, Bethune International Peace Hospital of PLA, Shijiazhuang 050082, China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of follicle stimulating hormone (FSH) and vascular endothelial growth factor (VEGF) on follicular endocrinic function of ovarian tissues after vitrification and autologous heterotopic transplantation. MethodsA total of 30 female Wistar rats were randomly divided into group A, B and C (n=10 for each group). Group A was transplanted with fresh tissues; group B and C were transplanted with resurgent tissues after cryopreserved for 2 weeks by direct cover vitrification (DCV) method, but group C received FSH and VEGF with intramuscular injection 2 d before the transplantation for consecutive 5 d. After heterotopic auto transplantation for 6 weeks, values of follicular density were calculated; serum estradiol (E2) levels were detected; expressions of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) were detected, and the values of uterine weight were measured. ResultsThere were no statistically significance differences in survival rates of ovarian tissues among the 3 groups (P>0.05). The values of follicular density, serum E2level, positive rate of PCNA and uterine weight in group A and C were higher than those in group B (P<0.05), but there were no statistically significant differences in the values between group A and C (P>0.05). ConclusionVEGF and FSH of intramuscular injection before the transplantation for ovarian tissues after vitrification and resuscitation can effectively increase the survival rate of ovarian tissues and improve the recovery of follicular endocrinic function.

[Key words]Follicle stimulating hormone； Vascular endothelial growth factors； Ovary; Cryopreservation; Transplantation, autologous; Rats, Wistar

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.05.04

[文献标志码][中国图书资料分类号]R715；R-332A

[文章编号]2095-140X(2015)05-0013-04

[通讯作者]吴小华，E-mail：xiaohuawu65@sohu.com

[基金项目][作者单位]050082 石家庄，解放军白求恩国际和平医院生殖医学中心