甲状腺毒症患者单个核细胞Foxp3检测分析

张 健 刘彦明 管振祺 何凤屏

甲状腺毒症患者单个核细胞Foxp3检测分析

张 健 刘彦明 管振祺 何凤屏*

目的：检测分析弥漫性毒性甲状腺肿(Graves病)和亚急性甲状腺炎患者单个核细胞叉头状/翼状螺旋转录因子3(Foxp3)阳性率和血浆甲状腺球蛋白抗体(TGAb)、甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)浓度变化。方法：采用流式细胞分析技术分别检测32例Graves病患者(Graves病组)、27例亚急性甲状腺炎患者(亚甲炎组)及30例健康对照者(对照组)外周血单个核细胞Foxp3阳性率；化学发光法测定血浆TGAb、TPOAb水平，比较组间各指标的差异，并分析Graves病患者单个核细胞Foxp3阳性率与血浆TGAb、TPOAb水平的相关性。结果：Graves病组单个核细胞Foxp3阳性率显著低于对照组和亚甲炎组，差异有统计学意义(P<0.05)，Graves病组TGAb、TPOAb水平均明显高于对照组和亚甲炎组，差异亦有统计学意义(P<0.05)；Graves病患者单个核细胞Foxp3阳性率与血浆TGAb和TPOAb水平均呈负相关(r=-0.70、-0.63,P<0.05)。结论：Foxp3、TGAb、TPOAb检测可为Graves病与亚急性甲状腺炎的诊断和鉴别诊断提供实验室依据。

甲状腺毒症；叉头状/翼状螺旋转录因子3；甲状腺球蛋白抗体；甲状腺过氧化物酶抗体

初诊甲状腺疾病多以甲状腺毒症为其主要表现，临床上常见弥漫性毒性甲状腺肿(Graves病)与甲亢期亚急性甲状腺炎。近年来发现叉头状/翼状螺旋转录因子3(Forkhead/Winged Helix Transcription Factor3,Foxp3)作为CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)的特征性转录分子，在诸多疾病包括甲状腺疾病发病中起着关键的作用[1]。本文通过流式细胞分析技术检测32例Graves病与27例甲亢期亚急性甲状腺炎患者外周血单个核细胞Foxp3阳性率，同时采用电化学发光法测定血浆甲状腺球蛋白抗体(TGAb)、甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)水平，并分析Foxp3与TGAb和TPOAb的相关性，为临床诊断甲状腺毒症提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料

病例为2014-03—2014-11广东省粤北人民医院内分泌科门诊或住院患者。Graves病32例(Graves病组)，其中男10例，女22例，年龄18-64岁，平均39.2±9.7岁，诊断依据：有高代谢症临床表现；心率加快，甲状腺肿大，手震颤，甲状腺相关眼病表现，胫前黏液水肿等体征；FT4和FT3水平升高，TSH水平降低；甲状腺静态显像ECT核素扫描显示放射性摄取功能增加。甲亢期亚急性甲状腺炎27例(亚甲炎组)，男7例，女20例，年龄19-66岁，平均40.6±10.0岁，诊断依据：有颈部疼痛或甲状腺部位压痛；C反应蛋白或血沉水平升高；FT4和FT3增高，TSH水平降低；甲状腺静态显像ECT核素扫描显示放射性摄取功能减低，部分病例行细针穿刺活检显示可见大量多核巨细胞。所有病例半年内均未应用糖皮质激素等免疫抑制剂或增强剂及放射碘治疗的初诊病人，且排除其它甲状腺疾病及糖尿病、肾病、结核病等其它内科疾病。选取同期于该院体检中心体检健康者30例作为对照组，男9例，女21例，年龄19-65岁，平均38.8±9.1岁。各疾病组和对照组间年龄、性别等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 主要仪器和试剂

流式细胞仪(美国BD公司，型号BD FACS Calibur)；电化学发光仪(瑞士Roche公司，型号E602)。藻红蛋白(PE)标记的鼠抗人Foxp3单抗(美国eBioscience公司，批号E09963-300)，异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鼠抗人CD4抗体、别藻青蛋白(APC)标记的鼠抗人CD25抗体(美国BD公司，批号20131013/20130806)，人淋巴细胞分离液(上海华精高科技有限公司，批号110504)，含固定剂、溶血剂和透膜剂的Perfix-P试剂盒(美国贝克曼公司，批号B08488)，TGAb、TPOAb、FT3、FT4检测试剂(瑞士Roche公司，批号173976/175454/175509/175155)。

1.3 单个核细胞Foxp3阳性率测定

抽取2ml外周血置入EDTA-K2抗凝管内，经人淋巴细胞分离液提取单个核细胞，调整细胞密度为1×107/ml。取100μl细胞悬液加入100μl固定液中振荡混匀，室温孵育10min后加裂解液500μl,充分混匀后放入37℃水浴箱孵育15min，加入冷洗涤液1ml, 2 000r/min离心4min后弃上清,加入90%甲醇1ml于冰上破膜30min，2 000r/min离心5min弃上清，最后加入冷洗涤液100μl重悬细胞。胞内抗体可与膜表面抗体一起孵育染色, PE标记的鼠抗人Foxp3抗体、FITC标记的鼠抗人CD4抗体、APC标记的鼠抗人CD25抗体各20μl同时加入，孵育30min后洗涤、离心、弃上清液，加细胞重悬液500μl混匀。上流式细胞仪检测，以CD4设门分析单个核细胞Foxp3阳性率。

1.4 FT3、FT4及TGAb、TPOAb测定

所有对象采集3ml静脉血于肝素锂抗凝试管中，离心分离血浆，排除溶血及高脂血标本，采用化学发光法，按常规操作，4h内完成检测。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 各组单个核细胞Foxp3阳性率、TGAb、TPOAb、FT3、FT4水平比较

各组各指标水平差异具有统计学意义(P均<0.05)。与对照组和亚甲炎组比较，Graves病组患者单个核细胞Foxp3阳性率明显降低，血浆TGAb、TPOAb水平明显升高，差异均有统计学意义(与对照组比较：t=5.78、9.23、12.67；与亚甲炎组比较：t=4.81、6.59、12.18，P均<0.05)。对照组和亚甲炎组以上三指标差异均无统计学意义(t=0.80、0.73、0.46，P均>0.05)。与对照组比较，Graves病组和亚甲炎组患者血浆FT3、FT4水平均升高，差异有统计学意义(Graves病组：t=10.65、7.54；亚甲炎组：t=5.73、6.02，P均<0.05)。Graves病组患者血浆FT3水平较亚甲炎组升高更明显(t=4.50，P<0.05)，两组间血浆FT4水平差异无统计学意义(t=1.24，P>0.05)。见表1。

表1 各组Foxp3、TGAb、TPOAb、FT3、FT4检测结果比较

注：与对照组比较，1)P<0.05；与亚甲炎组比较，2)P<0.05

2.2 Graves病患者Foxp3阳性率与TGAb、TPOAb水平的相关性分析

Graves病患者单个核细胞Foxp3阳性率与血浆TGAb和TPOAb水平均呈负相关(r=-0.70、-0.63,P均<0.05)。

3 讨 论

甲状腺毒症是指组织暴露于过量甲状腺激素中发生的以高代谢症候群为临床表现的一组综合症。Graves病与亚急性甲状腺炎同为常见的甲状腺疾病，两者都可因甲状腺激素水平升高而表现为甲状腺毒症。Graves病原发于自身免疫过程紊乱，致甲状腺激素过度产生而引起甲状腺毒症[2]；亚急性甲状腺炎急性发作期因甲状腺滤泡的完整性被破坏，滤泡内贮存的甲状腺激素漏出使患者血循环中含量增多[3]。临床上对这两种不同原因甲状腺疾病的鉴别诊断还未找到确切且简单易行的方法。

本文检测结果显示，Graves病与亚急性甲状腺炎患者血浆FT3、FT4水平都较对照组明显增高，而Graves病组FT3水平升高更显著，其原因可能是Graves病患者自身甲状腺功能高于正常水平，T4向T3转化增强致T3及FT3增高；而亚急性甲状腺炎患者的甲状腺功能低于正常。张红梅等[4]根据这一特点，通过FT3/FT4比值探讨了鉴别Graves病和亚急性甲状腺炎的分界值，但不管采用何种界值，两者始终存在重合，说明此鉴别方法虽然简单易行，但特异性不强。丁正强等[5]采用甲状腺摄碘率鉴别亚急性甲状腺炎和Graves病，灵敏度高，特异性强，但该方法检查时间长，且需内服放射性药物，对于妊娠期患者更是被禁止，因此在大多数医院并不作为常规检查项目。

Graves病是一种器官特异性自身免疫性疾病，涉及多个环节，机制亦未完全阐明，有研究表明其可能与TGAb、TPOAb水平升高密切相关[6]。Foxp3特异且稳定地表达于CD4+CD25+Treg细胞亚群,是其敏感标记，对CD4+CD25+Treg发育和发挥免疫抑制作用具有重要影响，可能是Graves病发病机制中的一个重要因素[7,8]。亚急性甲状腺炎患者多有上呼吸道感染史，一般认为与病毒感染有关；也有学者提出该病患者甲状腺组织受炎症破坏后释放出自身抗原，可通过直接或间接方式激活辅助性T淋巴细胞，因此伴随病毒事件的同时不排除自身免疫异常[9]。本文结果显示，Graves病患者外周血单个核细胞Foxp3阳性率较对照组和亚甲炎组患者明显降低，与钱伟等[10]研究结果一致。相关性分析显示外周血单个核细胞Foxp3阳性率与血浆TGAb、TPOAb水平均呈负相关，提示Graves病患者外周血CD4+CD25+Tregs数量减少或者Treg功能受损，导致免疫耐受机制破坏，持续激活体内自身反应性T细胞对自身甲状腺组织免疫应答，产生大量TGAb和TPOAb，使血浆水平较对照组显著增高，与吴定昌等[11]研究结果基本一致。有关Foxp3与亚急性甲状腺炎的研究少见相关报道，本文检测结果显示亚甲炎组患者单个核细胞Foxp3阳性率与对照组接近，同时外周血TGAb、TPOAb的水平亦与对照组无统计学差异，与汪亚丽[12]观察到的结果相同，该结果有利于进一步补充其与Graves病的鉴别诊断方法。

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本文第一作者简介：

张 健(1977-)，男，汉族，硕士，主管技师

1 王 荣, 张 健, 秦 秋，等. Foxp3在自身免疫性甲状腺病患者外周血和病变组织中的表达[J]. 西安交通大学学报(医学版),2012,33(1): 56-60.

2 Clarke NJ, Zhang Y, Reitz RE. A novel mass spectrometry-based assay for the accurate measurement of thyroglobulin from patient samples containing antithyroglobulin autoantibodies[J]. J Investig Med,2012, 60(8): 1 157-1 163.

3 Nishihara E, Ohye H, Amino N, et al. Clinical characteristics of 852 patients with subacute thyroiditis before treatment[J]. Intern Med,2008, 47(8): 725-729.

4 张红梅, 祖力菲亚·沙吾提, 阿布力克木·吐尔地. 甲状腺激素检测在甲状腺毒症病因鉴别诊断中的临床应用价值[J]. 标记免疫分析与临床,2012,19(2): 82-85.

5 丁正强, 袁 超, 殷 锴, 等. 甲状腺摄碘率测定在亚急性甲状腺炎和甲状腺功能亢进症诊断与鉴别诊断[J]. 安徽医学,2012,33 (7): 853-855.

6 Chou KM, Huang BY, Chen CH, et al. Correlation and presentation of thyroid functional status with thyroid autoantibodies in long-term follow-up of autoimmune thyroiditis: A study of 116 cases[J]. J Formos Med Assoc,2013,20(13): 370-377.

7 Zhou J, Bi M, Fan C, et al. Regulatory T cells but not T helper 17 cells are modulated in an animal model of Graves' hyperthyroidism[J]. Clin Exp Med,2012, 12(1): 39-46.

8 Morris GP, Brown NK, Kong YC. Naturally-existing CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells are required for tolerance to experimental autoimmune thyroiditis induced by either exogenous or endogenous autoantigen[J]. J Autoimmun,2009,33(1): 68-76.

9 D'Amico G, Di CV, Caleo A, et al. Sub-acute thyroiditis in a patient on immunosuppressive treatment[J]. Recenti Prog Med, 2013, 104(7-8): 459-461.

10 钱 伟, 张 强, 吴汉妮. Foxp3在Graves病患者外周血单个核细胞中的表达及临床意义[J]. 中国免疫学杂志,2011,27 (1): 76-78.

11 吴定昌, 黄超林, 肖 婷. 血清TGAb、TPOAb检测在自身免疫性甲状腺疾病诊断中临床意义[J]. 检验医学与临床,2013, 10(19): 2 530-2 531.

12 汪亚丽. 2个项目检测在甲状腺功能诊断中的临床价值[J]. 检验医学与临床,2013,10(10): 1 303-1 304.

汕头大学医学院附属粤北人民医院检验科，韶关 512026；*

，E-mail：fengphe@hotmail.com

本文2014-12-18收到，2015-02-17修回

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1005-1740(2015)02-0049-03