荔枝核总黄酮对活化大鼠肝星状细胞的增殖抑制作用及TLR4表达的影响

董 勇，赵永忠，肖绪华，刘燕秀，李 彩，成秋宸

荔枝核总黄酮对活化大鼠肝星状细胞的增殖抑制作用及TLR4表达的影响

董 勇，赵永忠，肖绪华，刘燕秀，李 彩，成秋宸

摘要目的 研究荔枝核总黄酮（TFL）在体外对活化的大鼠肝星状细胞（HSC-T6）的增殖抑制作用及Toll样受体4 （TLR4）表达的影响。方法 使用转化生长因子β1（TGF-β1）（5 ng／ml）激活HSC-T6，显微镜下观察HSC-T6和激活的HSC-T6形态变化；CCK8试剂盒（CCK8）法观察TFL作用24、48、72 h后活化的HSC-T6的增殖情况；逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测HSC-T6中TLR4的表达；流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡。结果 显微镜下观察HSC-T6和激活的HSC-T6形态有明显变化；CCK8结果显示TFL可以抑制HSC-T6的增殖（P＜0.05），并且随着TFL浓度和作用时间增加，HSC-T6增殖明显下降，呈浓度依赖性；RT-PCR结果显示随着TFL浓度增加，HSC-T6中TLR4表达下降，与实验对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；流式细胞仪检测结果表明TFL阻滞细胞于S期，G0／G1期细胞减少（P＜0.05），S期细胞增加（P＜0.05），促进细胞的凋亡（P＜0.05），呈浓度依赖性。结论 TFL可以抑制HSC-T6的增殖，其作用机制可能是通过降低TLR4在HSC-T6中的表达，阻滞其细胞增殖和诱导细胞凋亡，达到抗肝纤维化效果。

关键词荔枝核总黄酮；肝星状细胞；TLR4；细胞凋亡；流式细胞术

2015－01－12接收

作者单位：桂林医学院附属医院消化内科，桂林 541001

肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）是细胞外基质的主要来源，在肝纤维化形成中起关键性作用，HSCs通过分泌多种细胞因子影响并加速肝纤维化的进程［1］。近年来国内外围绕以促进HSCs凋亡和胶原降解为靶标的抗肝纤维化研究成为热点，为肝纤维化的防治寻找突破口。研究［2］表明Toll样受体4（Toll-like receptors4，TLR4）／核因子-κB （nuclear factor-kappaB，NF-κB）信号通路为肝损伤时重要的肝细胞凋亡途径之一。该实验探讨荔枝核总黄酮（total flavone of litchi chinensis sonn，TFL）在体外对活化的大鼠肝星状细胞（HSC-T6）的增殖抑制作用及其机制，进一步探讨肝纤维化的发生机制，同时为TFL应用于临床治疗肝纤维化提供实验依据和理论基础。

1 材料与方法

1．1 实验材料和仪器 HSC-T6（中国科学院昆明动物研究细胞库）；TFL浓度为60%（南京泽郎生物有限公司）；高糖型的DMEM液体培养基；含有EDTA的胰蛋白酶和无EDTA的胰蛋白酶（美国Gibco公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（美国Hyclone公司）；转化生长因子β1（transforming growth factor-beta1，TGF-β1）（美国Peprotech公司）；CCK8 （cell cunting Kit-8）购自中国碧云天生物技术研究所；逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）反应体系：总RNA提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒及扩增试剂盒（中国天根生物有限公司）；Markers（北京康为生物科技有限公司）；流式凋亡试剂盒（北京四正柏生物科技有限公司）；流式周期试剂盒（碘化吡啶、RNA酶）；梯度PCR仪（德国Sigma公司）；倒置相差显微镜（德国蔡司）酶标仪；MLDEL680（美国伯乐公司）；流式细胞仪（美国BD公司产品）；TLR4及β-actin引物由美国Invitrogen公司设计合成。

1．2 实验分组 2 μgTGF-β1溶解于10 μl pH＝3.0浓度为10 mmol／L的柠檬酸，配成0.2 mg／ml的TGF-β1母液；称取60 mgTFL溶解于1 ml（100 μl DMSO＋900 μl 10%FBS的培养基）溶液中，配成1 ml的80 mg／ml的TFL母液，然后稀释成实验需要的不同浓度的药物样品的培养基，将细胞分为7组：①空白对照组：10%FBS的DMEM培养基；②实验对照组：10%FBS的DMEM培养基＋5 ng／ml TGF-β1；③TFL80组：10%FBS的DMEM培养基＋5 ng／ml TGF-β1＋80 μg／ml TFL；④TFL160组：10%FBS 的DMEM培养基＋5 ng／ml TGF-β1＋160 μg／ml TFL；⑤TFL320组：10%FBS的DMEM培养基＋5 ng／ml TGF-β1＋320 μg／ml TFL；⑥TFL640组：10% FBS的DMEM培养基＋5 ng／ml TGF-β1＋640 μg／

ml TFL；⑦TFL800组：10%FBS的DMEM培养基＋5 ng／ml TGF-β1＋800 μg／ml TFL。

1．3 细胞培养 HSC-T6在5%CO2、37℃恒温培养箱中培养，常规贴壁细胞培养，用体积分数为10%的FBS、质量浓度均为100 μg／ml的青霉素、链霉素的高糖培养基，2 d传代1次。

1．4 CCK-8法检测TFL对活化的HSC-T6增殖抑制率 将处于对数生长期的HSC-T6消化传代，计数并调整细胞数为2.5×104／ml密度接种于3块96孔板，每孔100 μl。细胞贴壁后换无血清培养基培养，24 h后换成含有不同浓度TFL的培养基继续培养，每个浓度5个复孔，分别培养24、48、72 h后每孔加10 μl的CCK-8溶液。恒温箱培养45 min，酶标仪于450 nm处检测吸光度（absorbance，A），计算细胞相对增殖抑制率，分析不同时间不同浓度的TFL对细胞增殖的影响程度。

1．5 RT-PCR检测HSC-T6中TLR4的表达 按照前述方法不同浓度样品干预培养细胞分组，培养细胞48 h。TLR4（上游引物：5′-TGCCTGAGACCAGGAAGCTTG-3′，下游引物：5′-CTTAAGATCTTCAGG GGGTTG-3′），扩增片段长度为152 bp；β-actin（上游引物：5′-AGGTGACAGCAGTCGGTTGG-3′，下游引物：5′-CGAAGGCTCATCATTCAAAA-3′），扩增片段长度为300 bp。TLR4及β-actin引物的退火温度均为55℃，34个循环。总RNA的提取、逆转录、PCR均按说明书操作。取5 μl的PCR产物，1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳钝化分离，凝胶成像分析仪下观察拍照，并应用SensiAnsys凝胶图像分析系统进行分析。

1．6 AnneXin V-7AAD／PE双染色法检测细胞凋亡 按照前述方法不同浓度样品干预培养细胞分组，培养细胞48 h，用不含EDTA的胰酶消化细胞，1 500 r／min离心10 min，收集细胞，弃上清液；PBS冲洗1次，1 500 r／min离心10 min，弃上清液，加入200 μl的缓冲液重选细胞；避光加入10 μl的AnneXin V-7AAD，室温避光孵育15 min，上机前加5 μl 的PE，补加300 μl的PBS缓冲液，混匀，流式细胞仪检测，MAfit LT3．3分析软件分析细胞凋亡率。

1．7 流式细胞仪检测细胞周期 细胞药物处理方法如上，用0．02%的胰酶消化细胞，制备细胞悬液，2 000 r／min离心10 min，弃上清液，PBS冲洗2次，弃上清液，加1 ml PBS悬浮细胞，在振荡器上缓慢加入3 ml的冰无水乙醇，4℃冰箱过夜保存固定细胞。次日，2 000 r／min离心10 min，PBS冲洗1次，每个样本加入500 μl体积分数为50 μg／ml的PI，100 μg／ml RNAse，重悬细胞，37℃避光孵育30 min，上机检测分析。

1．8 统计学处理 采用SPSS 13．0软件进行统计学分析，计量资料以±s表示。多样本间比较用单因素方差分析，两组间比较采用LSD t检验，检验水准以α＝0.05。

2 结果

2．1 HSC-T6与其形态学变化 正常HSC-T6与被TGF-β1诱导后活化的HSC-T6常规培养，显微镜下观察，形态有明显差异。HSC-T6分散生长，而被TGF-β1激活的HSC-T6岛状聚簇生长。见图1。

2．2 TFL抑制HSC-T6的增殖 随着TFL浓度和作用时间增加，HSC-T6增殖明显下降且具有量效关系。TFL组A值与实验对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1　各组HSC-T6的A值（±s）

表1　各组HSC-T6的A值（±s）

F1：同一时间点组间A值比较；F2：组内不同时间点A值比较；与空白对照组比较：*P＜0.05；与实验对照组比较：＃P＜0.05；与TFL80组比较：ΔP＜0.05；与TFL160组比较：＆P＜0.05

组别　24 h　48 h　72 h　F2值空白对照＜0．05 0．884±0．062　0．863±0．014　0．849±0．082　0．345实验对照　0．973±0．078　0．985±0．013　1．074±0．166*　1．099 TFL80　0．829±0．054　0．847±0．037＃　0．770±0．086＃　1．712 TFL160　0．812±0．030＃　0．828±0．026＃　0．726±0．090＃　3．665 TFL320　0．777±0．063＃　0．723±0．083＃　0．716±0．031＃　1．284 TFL640　0．716±0．063*＃　0．649±0．088*＃Δ＆　0．611±0．041*＃2．967 TFL800　0．711±0．078*＃　0．643±0．080*＃Δ＆　0．609±0．070*＃2．057 F1值，P值　8．374，＜0．05　18．861，＜0．05　15．757，

2．3 TFL抑制HSC-T6中TLR4的表达 RT-PCR检测结果显示与实验对照组相比，空白对照组中TLR4的表达有明显差别，TLR4／β-actin比值差异有统计学意义（P＝0.000）；TFL组随着培养液中TFL浓度增加，HSC-T6中TLR4的表达有明显趋势，

TLR4／β-actin比值差异有统计学意义（F＝146.081，P＝0.000）。见图2、3。

2．4 TFL对HSC-T6凋亡和周期的影响 流式细胞仪检测结果显示TFL阻滞细胞于S期，G0／G1期细胞减少（P＜0.05），S期细胞增加（P＜0.05），促进细胞的凋亡（P＜0.05），具有浓度依赖性。见表2、3，图4、5。

表2　各组细胞的凋亡率（%，±s）

表2　各组细胞的凋亡率（%，±s）

F：同一时间点组间细胞总凋亡率比较；与空白对照组比较：*P＜0.05；与实验对照组比较：＃P＜0.05；与TFL80组比较：ΔP＜0.05；与TFL160组比较：＆P＜0.05；与TFL320组比较：οP＜0.05；与TFL640组比较：¤P＜0.05

组别　　早期凋亡率　　晚期凋亡率　　细胞总凋亡率空白对照4．13±0．31　4．17±0．40　8．30±0．70实验对照　1．47±0．35　3．80±0．40　5．27±0．75 TFL80　9．30±0．35*＃　5．50±0．50　14．80±0．61*＃TFL160　14．80±0．26*＃Δ　12．97±0．15*＃Δ　27．77±0．31*＃ΔTFL320　19．73±1．17*＃Δ＆　11．17±0．76*＃Δ　30．90±1．01*＃ΔTFL640　32．10±2．46*＃Δ＆ο　19．83±1．46*＃Δ＆ο　51．93±3．26*＃Δ＆οTFL800　36．23±1．62*＃Δ＆ο¤　23．17±1．04*＃Δ＆ο¤　59．40±2．65*＃Δ＆ο¤F值，P值　360．318，＜0．05　284．748，＜0．05　457．936，＜0．05

表3　各组细胞的周期百分比（%，±s）

表3　各组细胞的周期百分比（%，±s）

F：同一时间点组间细胞作用时期比较；与空白对照组比较：*P＜0.05；与实验对照组比较：＃P ＜0.05；与TFL80组比较：ΔP＜0.05；与TFL160组比较：＆P＜0.05；与TFL320组比较：οP＜0.05

组别　G1期　S期　G2期空白对照组74．54±3．55　18．03±3．93　7．43±0．56实验对照组　75．82±3．62　15．06±3．89　9．12±0．69 TFL80组　63．90±1．39*＃　27．53±2．01*＃　8．57±1．47 TFL160组　57．37±1．57*＃Δ　32．68±2．34*＃　9．95±1．54 TFL320组　54．84±0．95*＃Δ　36．06±0．80*＃Δ　9．10±1．61 TFL640组　46．15±0．41*＃Δ＆ο　47．18±2．73*＃Δ＆ο　6．68±3．11 TFL800组　44．83±1．59*＃Δ＆ο　49．92±1．72*＃Δ＆ο　5．25±1．32＆F值，P值　128．920，＜0．05　3．919，＜0．05　97．532，＜0．05

3 讨论

肝纤维化的形成是一个极为复杂的生理病理过程，牵涉到致病机体反应、细胞因子、反应靶细胞、细胞产物过量表达、抑制因素、降解酶等多种因素的作用。目前的研究［3-4］证实HSCs的激活，转化为肌成纤维细胞并分泌细胞外基质是肝纤维化发生、发展的核心环节。而研究［5］表明HSCs的激活与内毒素有关，脂多糖可能直接激活HSCs，与其表面的TLR4结合并进而激活NF-κB和JNK信号通路，诱导炎性细胞因子和黏附分子的表达，从而促使了纤维化的形成［6］。Paik et al［7］发现活化的HSCs表达TLR4和其辅助受体髓样分化蛋白2和CD14。研究［8-9］显示，TLR4可上调各类趋化因子（单核趋化蛋白1、巨噬细胞炎症蛋白1α、库普弗细胞、巨噬细胞炎症蛋白1β、调节正常T细胞表达和分泌因子、巨噬细胞炎症蛋白2、干扰素诱导蛋白10）和TLR2的表达，而通过接头蛋白髓样细胞分化因子途径和NF-κB途径下调静止的HSCs的TGF-β仿真受体Bambi （BMP and the activin memebrane-bound inhibitor）来增加TGF-β介导的HSC活化及其胶原的产生，促进肝纤维化。研究［10－11］证明TLR4和NF-κB可以在胆管阻塞型大鼠肝组织内高表达，大剂量TFL可以通过抑制大鼠组织TLR4和NF-κB的表达，改善胆管阻塞型肝大鼠纤维化程度。HSC-T6是否高表达TLR4以及TLR4对HSC-T6的生物学活性有什么影响尚需进一步研究。

研究［7］证明来活化的HSCs中TLR4表达水平很低，不表达髓样分化蛋白2和CD14；活化的HSCs 中TLR4、髓样分化蛋白2和CD14表达明显增加。本实验将活化的HSC-T6作为靶点，采用不同时间不同浓度的TFL作用于HSC-T6。RT-PCR结果显示HSC-T6在mRNA水平上可以表达TLR4，随着药物浓度增加，TLR4的表达降低，呈浓度依赖性。进一步观察TLR4与HSC-T6增殖和凋亡的关系，CCK8及流式细胞术检测显示TFL阻滞细胞于S期即DNA合成期，促进细胞的凋亡，降低TLR4的表达可以促进HSC-T6的凋亡［12－13］。实验证明TFL通过降低TLR4在HSC-T6中的表达，阻滞细胞增殖和诱导细胞凋亡，达到抗肝纤维化效果。

从白桦树中提取的BA通过抑制TLR4／MyD88／NF-κB信号通路，有显著的抗纤维化作用［14］。MyD88抑制剂ST2825治疗肝纤维化也有较好的疗效［15］。随着对TLR4更深入的研究，其通路将成为抗纤维化治疗的新的突破点。TFL作为此信号传导药物研究的一个热点，其抗肝纤维化具有显著疗效［10－11，16－18］。但是其对人类HSCs的增殖是否有抑制作用及具有抗纤维化效果，尚需进一步研究。

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The total flavone of litchi chinensis sonn inhibits the proliferation of actived hepatic stellate cells via the TLR4 pathway in rats

Dong Yong，Zhao Yongzhong，Xiao Xuhua，et al
（The Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin 541001）

AbstractObjective To investigate the anti-proliferative effect of total flavone of litchi chinensis sonn（TFL）on the activated hepatic stellate cells（HSC-T6）in vitro and the influence on Toll-like receptors 4（TLR4）．Methods HSC-T6 were activated with TGF-β（5 ng／ml）and then divided into the following groups：blank control，experimental control，five experimental groups．Different morphological changes of HSC-T6 and HSC-T6 were observed under the microscope．CCK8 was used to observe the proliferation of three kinds of the activated HSC-T6 which had been respectively affected by TFL for 24，48 and 72 h．The expressions of TRL4 were detected by RT-PCR（for mRNA）．The cell cycle and cell apoptosis were detected by flow cytometry（FCM）．Results There were obvious morphological changes of HSC-T6 and HSC-T6 under the microscope．The results of CCK8 showed that TFL could inhibit the proliferation of HSC-T6（P＜0.01），and HSC-T6 decreased significantly with the increase of the concentration and action time of TFL．It could be found in the results of RT-PCR that expressions of TLR4 of HSC-T6 declined with the increase of TFL concentration．There were visible differences compared with the experimental control（P＜0.01）．The test of FCM showed that TFL retarded the cells during PeriA S，G0／G1cells reduce（P＜0.01）and then promoted the apoptosis of cells（P＜0.01）．So it depended on the concentration of TFL．Conclusion TFL can inhibit the proliferation of HSC-T6，whose mechanism is to inhibit the proliferation of cells and induce the cell apoptosis by reducing the expressions of TLR4 in HSC-T6，so as to have the effect of anti-liver fibrosis．

Key wordstotal flavone of litchi chinensis sonn；hepatic stellate cells；Toll-like receptors 4；cell apoptosis；flow cytometry

作者简介：董 勇，男，硕士研究生；赵永忠，男，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：13607736670＠163．com

基金项目：国家自然科学基金（编号：81360659）；广西自然科学基金（编号：2012GXNSFAA053105）

文献标志码A

文章编号1000－1492（2015）04－0432－05

中图分类号R 575