人巨细胞病毒pUL76蛋白非保守C端与蛋白聚集体形成的研究

张文昌，陈敬贤，2，王明丽

人巨细胞病毒pUL76蛋白非保守C端与蛋白聚集体形成的研究

张文昌1，陈敬贤1，2，王明丽1

摘要目的 通过分别构建人巨细胞病毒（HCMV）UL76基因编码蛋白的全长以及保守N端和非保守C端的真核表达质粒，探讨pUL76引起核内蛋白聚集体形成的决定序列。

方法 根据GenBank中HCMV AD169（FJ527563．1）株基因序列设计分别用于扩增pUL76全长以及保守N端和非保守C端的引物，将3段序列分别构建至增强型绿色荧光蛋白表达载体（pEGFP-N1）中，经双酶切和测序验证重组质粒的正确构建。空载体和3种重组质粒分别瞬时转染人胚肺成纤维细胞（HELF）和人肝癌细胞（HepG-2），经逆转录（RTPCR）和Western blot法验证各段基因的正确表达，在荧光显微镜下观察转染不同重组质粒后细胞核内蛋白聚集体形成的状态。结果 pEGFP-N1空载体和pUL76保守N端均不能引起核内蛋白聚集体的形成，而pUL76及其非保守C端均能够引起核内蛋白聚集体的形成。结论 pUL76非保守C端是其引起核内蛋白聚集体形成所必须的。

关键词人巨细胞病毒；UL76；蛋白聚集体

2015－01－19接收

作者单位：1安徽医科大学微生物学教研室，合肥 230032

2哥伦比亚大学病理与细胞生物学系，纽约 10032

疱疹病毒有着相似的结构和复制周期，有一些基因行使着相同或相近的功能，比如用于DNA合成的DNA聚合酶、转录调节因子等。现已知疱疹病毒家族的3个亚科中约有40个核心基因来自共同祖先［1］，且这些基因在3个亚科中都保守。通常将从共同祖先继承而来，在不同亚科中的同源基因构成1个基因家族。疱疹病毒UL24基因家族即属于这40个核心基因之一，其编码的氨基酸序列N端高度保守，C端变异较大［2］。该基因家族在病毒整个复制周期以及潜伏感染中的作用研究较少。人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）属于疱疹病毒β亚科，其UL76基因属于疱疹病毒UL24基因家族。研究［3］表明UL76转染细胞最显著的特征是引起细胞核内蛋白聚集体的形成。该研究通过分别构建pUL76及其保守N端和非保守C端的真核表达质粒，确定了pUL76引起蛋白聚集体的决定序列。

1 材料与方法

1．1 实验材料 HCMV AD169毒株由复旦大学医学院微生物学教研室提供；人胚肺成纤维细胞（human embryonic lung fibroblast，HELF）和人肝癌细胞（human hepatoma，HepG-2）购自美国ATCC公司；HELF细胞、HepG-2细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养基（内含100 U／ml青霉素，100 g／ml链霉素）在37℃、5%CO2条件下培养。pEGFP-N1质粒购自美国Clontech公司；脂质体2000购自北京Invitrogen公司；T4 DNA连接酶、BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶和逆转录试剂盒购自立陶宛Fermentas公司；Rabbit-anti-GFP抗体、蛋白质提取试剂购自上海碧云天生物技术有限公司；引物由北京Invitrogen公司合成。

1．2 方法

1．2．1 质粒构建 PCR分别扩增出HCMV UL76全长、UL76保守N端和UL76非保守C端的编码序列。用于扩增各片段的PCR引物如下：UL76全长（325aa）F：5′-AAGCTTATGCCGTCCGGGCGT-3′，R：5′-GGATCCGCTAAAGACCGTGTGGGACGGCG-3′；

UL76N（1～190aa）F：5′-AAGCTTATGCCGTCCGGGCGT-3′，R：5′-GGATCCGCCCGTCCCAGATAGTC-3′；UL76C（187～325aa）F：5′-AAGCTTATGGACTATCTGGGACGGCG-3′，R：5′-GGATCCGCTAAAGACCGTGTGGGACGGCG-3′。各片段分别连接至pEGFP-N1真核表达载体，所形成的新的重组质粒分别命名为pEGFP-UL76、pEGFP-UL76N和pEGFP-UL76C。阳性克隆经双酶切和测序鉴定后，保菌并提取适量质粒DNA用于转染。

1．2．2 细胞转染和荧光显微镜观察 转染前1 d HELF细胞1×106／ml（或HepG-2细胞2×105／ml）密度铺于6孔板中。分别将2．5 μg质粒和5 μl脂质体2000混匀于500 μl无血清和抗生素的DMEM培养基中，室温静置5 min后将两者轻轻混匀，室温

放置20 min。在此过程中用PBS洗涤细胞3次，每次5 min。最后吸尽PBS，将1 ml混合液加到细胞中，37℃、5%CO2条件下培养24 h后换含有血清和抗生素的DMEM完全培养基，并于荧光显微镜下观察。

1．2．3 逆转录PCR（RT-PCR） 转染后48 h，用PBS洗涤细胞3次。6孔板每孔加入500 μl TRIzol试剂。RNA提取采用生工总RNA提取试剂盒（SK1322）。用于cDNA合成的RNA先用DNaseⅠ处理，然后由RevertAid First Strand cDNA Synthesis kits合成，每20 μl体系加1 μg模版RNA。RT-PCR所用引物同克隆引物。

1．2．4 Western blot法检测 转染后48 h，用PBS洗涤细胞3次。6孔板每孔加入150 μl蛋白裂解液（含PMSF 1 μmol／L），冰上裂解30 min，期间每隔10 min晃动平板使裂解液均匀覆盖。收集裂解液于－80℃保存。然后采用BCA法进行蛋白质定量。SDS-PAGE分离目的蛋白，250 mA恒流转膜80 min。转印了蛋白的PVDF膜用3%的脱脂奶粉封闭1 h。Rabbit-anti-GFP一抗1∶600倍稀释，孵育过夜。PBST洗涤3次后用HRP标记羊抗兔二抗（1 ∶5 000）孵育1 h，PBST洗涤3次后进行化学发光法曝光。

2 结果

2．1 PCR扩增UL76全长以及UL76保守N端和UL76非保守C端的编码序列 采用梯度退火温度摸索PCR扩增UL76、UL76保守N端（1～190aa）和非保守C端（187～325aa）3个不同片段的最适退火温度。PCR扩增结果经1%琼脂糖凝胶电泳。见图1。

2．2 UL76、UL76N（1～190aa）、UL76C（187～325aa）连接至pEGFP-N1 双酶切UL76、UL76N（1 ～190aa）、UL76C（187～325aa）连接至pEGFP-N1后转化大肠杆菌DH5α，卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆，阳性克隆扩大培养并提取质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切。见图2。酶切结果显示3种不同的片段都成功连接至真核表达载体pEGFP-N1上。

2．3 3种重组质粒测序结果与HCMV AD169株UL76基因比对 采用DNAMAN软件对测序结果与GenBank中登录的HCMV AD169株（FJ527563．1）UL76基因序列进行比对，散点图中对角线两侧相同位置出现相应的散点，表明序列有一致性。纵坐标代表目的序列，从下至上方向为读码框方向；横坐标代表3个重组质粒的测序结果，从左至右为读码框方向，A、B、C分别与目的序列全长、N端和C端序列相同。见图3。

2．4 pUL76、pUL76保守N端和pUL76非保守C端亚细胞定位的不同以及引起蛋白聚集体形成的差异 将4种质粒分别转染HepG-2细胞和HELF细胞。见图4、5。转染不同质粒后增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）可以很好的显示目的片段在细胞内的定位，另外蛋白聚集体可以通过荧光信号聚集在细胞内形成斑块样结构

来体现，图4 B、D中红色箭头箭头所指为细胞核内蛋白聚集体的形成。

2．5 RT-PCR和Western blot法验证各重组质粒的正确表达 因为目前没有商品化的UL76抗体，但是各重组质粒表达的融合蛋白均含有EGFP-tag，所以本研究采用抗EGFP抗体来检测各融合蛋白的表达。经蛋白质分子量预测，EGFP-tag按27 ku计算，各融合蛋白大小应为：pEGFP-N1为27 ku，pEGFP-UL76为63 ku，pEGFP-UL76N为49 ku，pEGFPUL76C为41 ku。见图7。

3 讨论

研究［2］表明疱疹病毒UL24家族成员都能够引起细胞周期阻滞，生物信息学分析显示该家族成员有潜在的核酸内切酶活性［4］。其他一些功能也在部分UL24家族成员中得到验证，如HSV-1 UL24（疱疹病毒α亚科）与病毒毒力相关［5］，能引起核仁素的重新分布等［6-7］。疱疹病毒β亚科的HCMV UL76不仅能够调节病毒自身基因（立即早期、早期以及晚期基因）的表达［8］，还能够调节宿主基因的表达，如诱导IL-8的表达［9］；致染色体损伤［10］；引起核内蛋白聚集体的形成［3］等。疱疹病毒γ亚科如KSHV的ORF20目前研究较少。

细胞内一些异常的或不正确折叠的蛋白会给细

胞本身代谢带来不利的影响，这些蛋白需要被及时识别和清理。在细胞质中，错误折叠的蛋白能够通过两种途径被降解：泛素化降解途径和溶酶体参与的自噬途径。而在细胞核中错误折叠的蛋白只能够通过泛素化降解途径来清理［11］，当错误折叠蛋白产生过多以致超出它们的降解能力或蛋白酶体功能自身受损（如泛素化蛋白受体S5a被扣留）后，错误折叠蛋白会进一步形成蛋白聚集体。一些严重的神经系统疾病如克雅病就是与细胞内错误折叠的蛋白不能够被清除，进而形成聚集体有关［12］。

研究［3］显示，UL76可以通过与泛素化降解途径受体S5a相互作用引起核内蛋白聚集体形成。本研究在重复其部分研究的过程中显示，引起核内蛋白聚集体形成并非由其保守N端决定，而是由非保守的C端决定。由于所克隆的片段均相同，区别仅在本课题组采用的真核表达载体为pEGFP-N1，而Lin et al［3］使用的是pEGFP-C1（本实验中目的基因位于EGFP N端，对方实验中目的基因位于EGFP C端），因此产生了截然相反的结果。而且通过核定位信号预测也表明pUL76所含有的核定位信号（205～245aa）位于非保守C端，现有的实验结果也证实只有pUL76和pUL76非保守C端定位于细胞核，而pUL76保守N端弥散分布于整个细胞。因此非保守的C端与细胞核内蛋白泛素化降解途径受体S5a相互作用更符合实际。

HCMV先天性感染主要累及中枢神经系统，可引起感音神经性耳聋、智力发育迟缓和小头畸形等。目前，HCMV致神经系统病变的确切机制尚不清楚。本研究通过截短表达UL76的不同片段，探讨pUL76引起细胞核内蛋白聚集体形成的决定序列，从而为进一步研究UL76的生物学功能以及其在HCMV致病中所扮演的角色奠定基础。

参考文献

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Unconserved C terminal of pUL76 in human ctomegalovirus elicits aggresome formation

Zhang Wenchang1，Chen Jingxian1，2，Wang Mingli1
（1Dept of Microbiology，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Dept of Pathology，Columbia University，New York 10032）

AbstractObjective To define the nuclear agrresome formation is determinated by which part of the UL76 of

HCMV．Full-length，conserved N terminal and unconserved C terminal of pUL76 were constructed to eukaryotic expression plasmid pEGFP-N1．Methods Primers were designed to amplify full-length and different part of pUL76 according to standard sequence of HCMV AD169 which had been submitted to GenBank（FJ527563．1）．These fragments were constructed to eukaryotic expression plasmid pEGFP-N1．The recombinant plasmids were designated pEGFP-UL76，pEGFP-UL76N，pEGFP-UL76C respectively．Double digestion and sequencing were performed to verify the accuracy of recombinant plasmids construction．Empty vector and three recombinant plasmids were transient transfected to HELF and HepG-2 cells respectively．Reverse transcriptation PCR and Western blot were performed to detect the RNA and protein expression level respectively．Different nuclear aggresome formations were visualized with an Olympus fluorescence microscopy．Results pEGFP-N1 and pEGFP-UL76N were unable to induce nuclear aggresome formation，whereas pEGFP-UL76 and pEGFP-UL76C were able to elicit nuclear aggresome formation．Conclusion The unconserved C terminal of pUL76 is sufficient to induce nuclear aggresome formation．

Key wordshuman cytomegalovirus；UL76；protein aggresome

作者简介：张文昌，男，硕士研究生；王明丽，女，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：mingliwang＠ahmu．edu．cn

基金项目：国家自然科学基金（编号：30872253）；安徽高校省级自然科学研究项目（编号：KJ2012ZD08）

文献标志码A

文章编号1000－1492（2015）04－0411－05

中图分类号R 349．64