RASSF1A Ala133Ser单核苷酸多态性与中国北方汉族结直肠癌的关联研究

冯凯，路浩军，贾海英，郑燕华，张军，景青萍，吴继华

无论在全球还是我国，结直肠癌(co lo recta l cancer，CRC)都是发生率与病死率最高的肿瘤之一[1]，男性较女性多发，且随年龄增加发病率逐渐增高。结直肠癌是基因与环境相互作用的结果，有家族倾向，但多为散发病例，并与生活方式密切相关[2-4]。

Ras相关区域家族1A(Ras association dom ain fam ily 1A gene，RASSF1A)是一个抑癌基因[5-7]，具有调节细胞周期、控制细胞凋亡、调节微管稳定性、抑制炎症等多种生理功能[8-11]，其表达水平及功能发挥与肿瘤的发生、发展有密切关系[12-14]。很多实体瘤中都检测到启动子区超甲基化导致的RASSF1A基因失活[15-17]，结直肠癌RASSF1A超甲基化率为31%[18]。但近来研究显示，RASSF1A基因遗传变异也能导致肿瘤发生[19]。RASSF1A基因较为保守，仅在肿瘤细胞中发现一些突变，单核苷酸多态性(SNP)数量少，其中以外显子3G/T多态性导致编码第133位氨基酸的密码子发生非同义突变(Ala/Se r)的研究最多，目前已 有针对不同肿瘤与RASSF1A Ala133Ser基因多态性遗传易感性的多项研究，包括肺腺癌、乳腺癌、肝癌、结直肠癌、头颈癌、食道癌、胃癌、肾癌、前列腺癌等[20-25]，但结果并不一致，有Meta分析结果显示，除与肺癌的易感性相关较为明确外，其他肿瘤结果由于种族和样本量等原因，还需要进一步确认[26]。目前结直肠癌与RASSF1A Ala133Ser关系的研究只有一篇日本人群的小样本报道[20]，中国人群尚无报道，人类单体型计划(in ternational hapMap p ro ject)数据库显示RASSF1A Ala133Ser SNP在欧洲、日本、中国汉族、非洲人群中的最小等位基因频率分布存在差异(从0.173至0.009)，本研究拟以中国北方汉族人群为对象，探讨RASSF1A Ala133Ser SNP与结直肠癌易感性的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 本研究共收集176例北方汉族结直肠癌患者，包括109例结肠癌(男61例，女48例，年龄64.6±14.1岁)及67 例直肠癌(男39例，女28例，年龄67.0±11.9岁)，所有病例均来自2011年10月－2013年7月解放军306医院普通外科和肿瘤科收治的手术或化疗结直肠癌患者，病理组织类型均为原发腺癌，排除了转移癌和其他类型肿瘤患者；189例与病例组年龄性别比例接近的北方汉族正常对照，随机选自在解放军306医院进行健康体检的人员，为排除遗传分层因素，所有入选者均经详细问卷调查，以查明其疾病史并排除有肿瘤病史者。样本采用EDTA-K2抗凝血。本研究经解放军306医院伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 血细胞DNA提取 采用酚-氯仿法从结直肠癌患者及正常人外周血白细胞抽提基因组DNA，溶解于TE缓冲液，–80℃保存备用。

1.2.2 降落式聚合酶链反应 参考序列(ch r3: 50,364, 001-50, 378, 500)，版本号GRCh37/hg19，采用在线Prim er 3软件(http://prim er3.ut.ee/)进行引物设计。P1引物5'-AAGGCAGTCAGTTTCCAAAGACT-3'，P2引物5'-ATGAAGAGGTTGCTGTTGATCTG-3'。PCR试剂均购自TaKaRa公司，采用GeneAm p PCR System 9700型(美国PE应用生物系统公司)基因扩增仪进行PCR扩增。反应体系25μl：20ng基因组DNA，10mm o l/L dNTP，10×缓冲液、引物各5pm o l，Ex Taq DNA聚合酶1U。反应条件：94℃ 5m in；94℃30s，64℃(–0.3℃/循环)30s，72℃ 30s，16个循环；94℃ 30s，56℃ 40s，72℃ 40s，20个循环；最后72℃10m in。产物保存于4℃。

1.2.3 基因型分析 取PCR反应产物10μl进行限制性内切酶AluⅠ酶切，酶切产物行2%琼脂糖凝胶电泳。以Cham pGel全自动凝胶成像分析仪(北京赛智创业科技有限公司)观察记录电泳结果。

1.2.4 结果验证 Ala/Ser基因型和Ser/Ser基因型均进行两次以上重复分型，对Ser/Ser基因型样本PCR产物进行测序(北京三博远志生物工程公司)证实。

1.2.5 RASSF1A蛋白序列保守性分析 利用Clustlw程序(h ttp://w ww.eb i.ac.uk/Too ls/m sa/c lusta lw 2/)对大鼠、小鼠、犬、类人猿、猕猴、人类的RASSF1A蛋白序列进行比对，蛋白序列检索自NCB I的蛋白数据库，序列号分别为XP_850255(Canis fam iliaris，犬)，XP_001168270(Pan trog lod y tes，类人猿)，NP_001032644(Ra ttus norvegicus，大鼠)，AAK21200(Mus m uscu lus，小鼠)，XP_001100583(Macaca m u latta，猕猴)，NP_009113(Hom o sapiens，人类)。

1.3 统计学处理 采用Fisher精确检验对对照组人群各基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡进行分析，以判断所选人群是否存在基因型或等位基因的分布偏差，从而确定其对整体人群的代表性。基因-疾病关联分析采用非条 件log istic回归模型，计算共显性、显性、隐性、超显性遗传模式下的比数比(odds ratio，OR)及95%可信区间(con fiden tial in tervals，CI)，并采用log istic回归模型进行基因-性别交互作用分析。所有统计均采用SNPsta ts[27]在线关联研究工具(http://bioin fo.iconco logia.net/SNPstats)进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般特征 结直肠癌组、结肠癌亚组、直肠癌亚组与对照组之间性别、年龄构成相似(P>0.05)。所有标本均成功进行了基因型分型(图1)，所有重复分型结果均与原结果相符。经χ2检验，健康对照组RASSF1A Ala133Ser基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.75)。

图1 RASSFA1 Ala133Ser 多态性分析Fig. 1 Po lym o rphism analysis o f RASSFA1 Ala133SerM. DL2000 DNA ladder; Lane 1 and 4. Ser/Serhom ozygous(227bp); Lane 2. Ala/Ser heterozygous (227bp, 169bp and 58bp);Lane 3 5, 6. Ala/Ala hom ozygous (169bp and 58bp)

2.2 RASSF1A Ala133Ser SNP与结直肠癌组及结、直肠癌亚组的关联研究 校正年龄、性别因素后，RASSF1A Ala133Ser SN P的Ala/Al a、Ala/Ser和Ser/Ser基因型频率在结直肠癌组与对照组之间，于各种遗传模式下差异无统计学意义(表1)。将结肠癌和直肠癌患者分成两个亚组分别与对照组进行关联分析，在四种遗传模式下差异也无统计学意义(数据未列出)。

表1 RASSF1A Ala133Ser 单核苷酸多态性与结直肠癌的关联分析(n=365)Tab. 1 Association analysis of RASSF1A Ala133Ser SNP and co lo rectal can cer (CRC) (n=365)

2.3 RASSF1A Ala133Se r SNP在结直肠癌及结、直肠癌亚组中的基因-性别交互作用 结直 肠癌及其亚组RASSF1A Ala133Ser SNP与性别存在交互作用，采用log istic回归检测显示，显性遗传C模式下，结直肠癌RASSF1A Ala133Ser SNP和性别存在交互作用，携带Ser等位基因(Ala/Ser+Ser/Ser)的女性患结直肠癌的比例比不携带 Ser等位基因的女性高(OR=3.01，95%CI 1.31～6.94，P<0.05，表2)，在其他三种遗传模式下未观察到交互作用(数据未提供)。为了观察这种交互作用是否与结直肠癌亚型有关，分别进行了结、直肠癌亚组中的基因-性别交互分析，结果显示，显性遗传模式下，RASSF1A Ala133Ser SNP与性别的交互作用主要体现在直肠癌亚组(OR=3.78，95%CI 1.31～10.89，P<0.05，表3)，而结肠癌组没有显著交互作用(表4)，即其他条件相同的情况下携带Ser等位基因的女性更易发生直肠癌。以上分析均校正了年龄因素。

2.4 RASSF1A蛋白序列保守性分析 RASSF1A是重要的抑癌基因，突变或失活常导致肿瘤发生，特别是关键的功能区，在进化过程中应相对稳定，RASSF1A结构注释显示，其蛋白第131位为ATM酶磷酸化位点，131－134为ATM/ATR磷酸化酶识别位区。我们比对了人、犬、小鼠、大鼠、猕猴、类人猿的RASSF1A蛋白参考序列，133位均为Ala，进一步提示了该位点功能的重要性(图2)。

表2 Log istic回归分析结直肠癌基因和性别的交互作用(n=365)Tab. 2 Interaction analysis of gene-sex involved in colorectal cancer (CRC), by log istic reg ression (n=365)

表3 Log istic回归分析直肠癌基因和性别的交互作用(n=256)Tab. 3 Interaction analysis of gene-sex invo lved in rectal cancer, by log istic reg ression (n=256)

表4 Log istic回归分析结肠癌基因和性别的交互作用(n=298)Tab. 4 Interaction analysis of gene-sex invo lved in co lon can cer, by log istic reg ression (n=298)

3 讨 论

图2 不同物种RASSFA1蛋白序列比对Fig. 2 Sequences align fo r RASSFA1 p ro tein from six speciesHomo. Homo sa piens; Canis. Canis fam iliaris; Pan. Pan troglodytes; Rattus. Rattus norvegicus; Mus. Mus musculus; Macaca. Macaca mulatta; 131-134. Iden tification region of ATM/ATR phosphatase; 131. Phospho rylation site of ATM/ATR phosphatase

本研究中，RA SSF1A Ala133Ser 基因型在结直肠癌及其亚组患者中的分布与正常对照相比，其差异无统计学意义，提示Ser/Ala与Se r/Ser基因型并没有显著增加结直肠癌的发 生危险。但是，本研究在全部对照样本中只发现1例Ser/Ser纯合子，这与Hapm ap数据库提供的中国汉族人群分布频率相吻合，但在肿瘤患者中共发现4例纯合子，表现出Ser/Ser肿瘤高发的倾向，并且杂合子比例也有所增高(15.3%/11.6%)，但差异无统计学意义，可能与样本量有限有关。

本研究发现RASSF1A Ala133Ser SNP与性别存在交互作用，女性携带Ser等位基因可增加患直肠癌的风险。一般研究都将结肠癌、直肠癌归为一类统称结直肠癌或大肠癌，但是这两 种肿瘤发生机制可能存在差异[28]。流行病学调查显示，结肠癌与直肠癌饮食上的风险因子不同[29]。最近Nature发表的一项研究显示，结肠癌与直肠癌有不少方面是一致的，如基因表达谱、DNA甲基化、拷贝数变化、m iroRNA变化，但二者仍然存在某些重要差别，特别是右结肠，好发由超甲基化、超突变引发的癌变[30]。另外，虽然CEA是结直肠癌早期诊断和复发的分子标记，但在结肠癌与直肠癌的表达水平明显不同[31]。目前，这方面的研究仍十分有限。本研究显示，抑癌基因RASSF1A 133Ser等位基因对于女性是一个较高的风险因素，其机制有待进一步探讨。

RASSF1A 133Ser增加肿瘤易感性，可能存在多种机制。RASSF1A蛋白可与微管结合，是调节有丝分裂[32]、防止高尔基体断裂、保持细胞极性的关键骨架蛋白[33]，133Ser多态性导致RASSF1A微管结合能力下降，不能与α和γ微管结合，只能与β微管结合，这样就降低了微管的稳定性，利于肿瘤的形成[34]。

RASSF1A蛋白参与细胞周期的调节，其机制是抑制cyclin D1控制G1/S期的转换。Shivakum ar等[8]报道RASSF1A蛋白的活化依赖磷酸化，RASSF1A Ala133Ser SNP则会对其磷酸化过程产生影响，与野生型133Ala相比，RASSF1A 133Ser变体没有抗细胞增殖活性，因此133Ser可能导致细胞循环控制受损。分析表明，RASSF1A的133Ala位于ATM/ATR家族S er/th reonine激酶识别位点“SQA”的区域，为磷酸位点识别所必需[35]，该位点在不同种属的哺乳动物中非常保守，本研究比较了大鼠、小鼠、犬、类人猿、猕猴和人类的RASSF1A蛋白序列，发现该位点均为Ala，进一步从进化角度证明了该位点的重要性。同时S131的磷酸化与DNA的损伤修复有关[36]，133Ser破坏了这一功能[37]。

近来已有研究证实RASSF1A Ala133Ser SNP与肿瘤特别是肺腺癌的发生有关。本研究结果显示RASSF1A Ala133Ser SNP与性别在直肠癌中存在交互作用，虽然样本量较少，但为后续研究提供了重要线索。

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