超声评价蛋白多糖对关节软骨水合作用的影响

杨依依，王青，牛海军，冯前进，陈武凡

关节软骨是一种表面光滑、富有弹性的结缔组织，可减少运动过程中骨面之间的摩擦，能够最大限度地吸收、缓冲应力作用[1]。关节软骨主要由大量细胞外基质与散在分布其中的软骨细胞组成，主要成分包括水(占软骨组织净重的60%～80%)、蛋白多糖(proteoglycan，占5%～10%)、胶原蛋白(collagen，占10%～20%)。软骨基质成分丢失和关节结构破坏是骨性关节炎的早期病理特征[2]。蛋白多糖是由大量的聚氨基葡萄糖通过连接蛋白连接于透明质酸链上，可吸引大量水分子形成凝胶，具有良好的弹性和膨胀能力。胰蛋白酶是一种蛋白溶解酶，能降解软骨内的蛋白多糖，从而破坏软骨的水合功能，使关节软骨失去弹性和抗压性。软骨成分改变可导致关节软骨退化，表现为软骨组织结构及其生物力学、组织学、生物化学性质改变[3-4]。本研究应用高频超声测量技术观察了蛋白多糖降解导致的关节软骨水合膨胀行为的改变，旨在探讨蛋白多糖对软骨水合作用的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 选取12块成年猪的新鲜髌骨，关节软骨表面光滑无破损，置于–20℃冰箱保存待用。以髌骨的外侧部分作为超声扫描部位。

实验前，将样本置于磷酸缓冲溶液(PBS)中解冻2h(室温保持25℃)。将12块猪髌骨软骨样本随机均分为2组：正常组作为参考样本，不做任何处理；胰蛋白酶消化组在0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液中浸泡8h，以消化软骨组织内的蛋白多糖，建立蛋白多糖降解软骨的离体退化模型，模拟自然骨性关节炎的软骨退化。消化过程在37℃恒温箱内进行，消化完成后使用pH 7.4的PBS冲洗3次，然后进行超声扫描测量。

1.2 仪器与方法 采用开放式综合A型超声测量实验系统。该系统由脉冲发射/接收仪(Olympus，Model 5800)、聚焦换能器(Panametrics，中心频率为25MHz)、12位的模数(A/D)采集卡(Gage，CompuS-cope 12400)及一台计算机(Lenovo)组成。扫描软骨样本时，先调整探头位置，使超声波垂直入射软骨组织，以获得清晰且幅度较大的回波信号。从软骨表面、组织内部及软骨与骨的交界面反射的回波被超声脉冲发射接收器接收放大后，经A/D转换卡将模拟信号转换为数字信号，通过GageScope信号采集处理软件(ver.3.80.02，Gage，Canada)进行实时显示，并自动存储到计算机硬盘，用于后续的离线数据分析。同时由A型超声信号的时间序列重建M型超声图像，可观察软骨组织随深度及时间的变化。

1.3 超声检测 将样品固定在容器底部，用生理盐水将其完全浸泡，观测所记录的A型超声信号，信号无波动则表明软骨在生理盐水中达到平衡状态。然后，先用针管抽净生理盐水，再用纸巾吸干软骨表面的水分，将样本于空气中暴露40min(保持恒温不变)。之后重新在容器中加入生理盐水，整个换液过程在30s内完成，之后以1帧/s的采样频率采集超声回波信号，连续记录40min后，软骨达到平衡状态。

1.4 参数计算 利用跟踪窗口选择感兴趣的超声回波信号(即软骨表面回波)，应用互相关算法计算超声波在水合过程中的时间偏移量ΔT，通过公式Δh=vsΔT/2可计算得到软骨表面位移(Δh)值，其中vs为超声在生理盐水中的声速，即1532m/s。通过超声在软骨组织中的声速vc及传播时间T可计算得到软骨的厚度(h0)。h0=vcT/2，其中vc为1675m/s。软骨的水合应变ε可通过公式ε=Δh/h0计算获得。

本实验中后期数据处理及参数提取均采用自编的Matlab 7.0程序来完成。

1.5 病理组织学评价 超声测量后的样品保存于福尔马林溶液中，待病理组织学分析。

将正常和退化后的软骨样本经洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片等步骤制成厚约5μm的石蜡切片，进行番红染色，在光学显微镜下观察其组织结构的变化，确定软骨的退化程度。

1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0进行统计分析，数据结果以s表示，应用非参数统计方法排除因样本量小带来的“随机显著性”[5]，两组间比较采用Mann-Whitney U检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 水合应变测定结果 经胰蛋白酶消化后，胰蛋白酶消化组的软骨组织厚度为1.34±0.04mm，与正常组(1.34±0.07mm)比较差异无统计学意义(P＞0.05)，但胰蛋白酶消化组软骨组织的平衡应变值为1.8%±0.2%，明显低于正常组(3.5%±0.5%，P＜0.05)。

M型超声图像可显示，与正常组比较，胰蛋白酶消化组水合膨胀幅度明显下降(图1)。跟踪软骨表面的超声回波信号，绘制出软骨表面随时间变化的水合膨胀动态应变，结果显示，正常组的软骨组织大约20min时达到平衡状态，而胰蛋白酶消化组在大约5min时即迅速达到平衡(图2)。

2.2 病理组织学检查结果 光镜观察显示，正常组软骨的蛋白多糖被番红染成红色，可见较多均匀一致的红色区域；蛋白多糖降解后(胰蛋白酶消化组)的关节软骨在软骨下层部分呈红色，提示有部分蛋白多糖存在，而软骨中上层番红染色减少，可见软骨细胞破坏，提示软骨蛋白多糖减少，软骨细胞破坏(图3)。

图1 两组关节软骨水合膨胀的M型超声图像Fig. 1 M-mode ultrasound image of hydration progress of articular cartilages

图2 正常组及胰蛋白酶消化组关节软骨的动态应变曲线Fig. 2 Dynamic strain curve of articular cartilages in normal group and trypsin group

图3 正常组及胰蛋白酶消化组关节软骨番红染色(×100)Fig. 3 Articular cartilages in normal group and trypsin group(Safranine O staining ×100)

3 讨 论

软骨的蛋白多糖具有完整的化学结构，即一个或多个糖胺聚糖汇聚在一个蛋白质核心上形成蛋白多糖，蛋白多糖结合透明质酸形成蛋白多糖聚合物[6]，糖胺聚糖中的负电荷在基质中则起着吸收和保持水分的作用。关节软骨的渗透性膨胀行为与Donnan渗透压下的水分含量和离子扩散紧密相关[7-8]，并表现出“过激松弛”的现象[9]。本研究超声检测发现，软骨脱水后的水合逐渐达到渗透性膨胀平衡而未表现出“过激松弛”现象。这种差异可能是由于软骨层中水分蒸发以及细胞外溶液中离子交换引起的溶液浓度改变所致。本研究结果表明，当正常的软骨组织放入生理盐水后，蛋白多糖对软骨的水合及脱水后恢复原状具有重要作用，蛋白多糖、离子和水之间的相互作用对关节软骨的机械力学性能具有重要影响。另有学者研究发现，脱水后的软骨组织容易发生损伤的原因之一是软骨中缺乏流体支撑[10]。

蛋白多糖降解可导致关节软骨的渗透膨胀性能下降[11-12]。研究显示，降解后的蛋白多糖变得不稳定，并容易从基质中流失，随着蛋白多糖的缺失，基质对水分的吸收及保持性能均下降[6]。但也有研究发现，糖胺聚糖的缺失可能只是影响软骨水合特性的因素之一[13]，蛋白多糖降解和胶原网架破坏均可导致软骨渗透性升高，故退化的软骨中水分含量增加[14-15]。在骨性关节炎中，关节软骨水分含量的改变通常与细胞外基质中蛋白多糖和胶原蛋白的含量及结构变化相关。为探讨蛋白多糖缺失对软骨水合的影响，本研究利用胰蛋白酶消化软骨中的蛋白多糖，观察经软骨表面水分蒸发引起软骨脱水后两组样本的水合特性，结果显示，蛋白多糖缺失可导致软骨水合膨胀性能显著降低。

高频超声可用于测量正常与退化关节软骨的渗透性膨胀行为[9,11-12,16]。本研究应用超声检测软骨的水合行为，跟踪变形组织，获取动态应变曲线和平衡应变值，定量评价蛋白多糖对软骨水合功能的影响。超声测量系统可非接触、无创地实时评估关节软骨组织的力学性能，在活体及体外原位测量中具有明显优势。本研究应用瞬态超声测量技术监测外部环境变化引起的关节软骨水合膨胀行为，结果显示，M型超声图像可清晰显示脱水后软骨的水合膨胀过程，利用互相关算法跟踪软骨表面的超声回波，可获取在水合过程中组织的膨胀程度，并计算动态应变和平衡应变。

综上所述，本研究通过高频超声系统，探讨了蛋白多糖对软骨水合膨胀的影响。该结果对关节软骨生物力学性能研究、软骨病变检测及人工关节软骨材料的研制均具有一定参考价值，同时对关节炎的早期诊断也具有潜在的应用价值。

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