中国南北方食管癌患者中p53基因外显子突变谱的差异研究

洪　强　谭家驹　姚维深　罗学平　周国华　谢敬廉　莫春生

作者单位：528200 广东省佛山市南海区人民医院胸外科(洪　强，姚维深，罗学平，周国华，谢敬廉，莫春生)；528000 广东省佛山市第一人民医院胸外科(谭家驹)



中国南北方食管癌患者中p53基因外显子突变谱的差异研究

洪强谭家驹姚维深罗学平周国华谢敬廉莫春生

作者单位：528200 广东省佛山市南海区人民医院胸外科(洪强，姚维深，罗学平，周国华，谢敬廉，莫春生)；528000 广东省佛山市第一人民医院胸外科(谭家驹)

【摘要】目的探讨南北方食管癌患者中抑癌基因p53全部编码外显子基因突变谱的差异。方法各选取揭阳居民食管癌患者42例，佛山患者52例，常规提取DNA，PCR扩增p53第2-11外显子全部编码区和附近的一部分非编码区，扩增产物用DHPLC进行突变的筛查。筛查出的突变样本进行DNA纯化测序分析，测序结果在NCBI网站进行p53突变位点的比对和定位。结果高、低发区组中p53至少有1个外显子基因突变的突变率分别为63.8%(28/42)和61.5%(32/52)，两者比较差异无统计学意义(P=0.607>0.05)； p53有2个外显子基因突变的突变率分别为14.3%(6/42)和15.4%(8/52)，两者比较差异也无统计学意义(P=0.881>0.05)。结论高低发区间可能具有相似的环境致癌物质，通过相同的p53基因突变机制导致了两地食管癌的发生。

【关键词】食管癌；变性高效液相色谱；基因突变

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:0039～0042)

食管癌发病率具有明显的地理分布特征。氮循环病因假说是现有多种食管癌的病因假说之一，氮循环中的硝酸盐、亚硝酸盐；胺类、酰胺类。这两类前体物进入人体，合成亚硝酰胺及亚硝胺，引发肝癌、胃癌、食管癌[1]。p53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因[2-4]，p53是致癌剂作用的靶基因之一，细胞暴露于不同的致癌剂时，常表现为不同的突变谱。本研究分析南方食管癌高低发区居民食管癌患者p53基因全部编码外显子基因突变谱的情况，比较两者p53基因突变的差异，进一步探索食管癌发生发展的分子生物学变化，为两者间是否存在相同或机似的环境致癌因素提供分子生物学依据。

1材料与方法

1.1研究对象

南方高发区组42例中男性32例，女性10例，年龄46～70岁，中位年龄59岁，来源于高发地区揭阳市人民医院的食管癌手术标本。佛山低发区组52例中，男性45例，女性7例，年龄44～78岁，中位年龄61岁，来源于低发区佛山市第一人民医院胸外科的食管癌手术标本。所有患者术前均未经过放疗和化疗，手术标本离体后迅速沿切缘到肿瘤方向从癌肿中间切分成两半，每半包括癌组织、癌旁组织、手术切缘组织三个部分，将一半冻存于液氮中然后转入-70℃冰箱保存，另一半用10%福尔马林液固定后送作病理诊断。所选标本切除后病理检查证实为鳞状细胞癌，癌旁组织均超过癌肿边缘3 cm。

1.2实验方法

1.2.1基因组DNA提取从-80℃冰箱中取出组织，切取食管癌组织25～30 mg，用TIANGEN组织基因组DNA提取试剂盒提取DNA。

1.2.2PCR反应扩增目的片段PCR反应引物根据有关文献报道[13]，并在美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站数据库进行比对。扩增的7个片段包括了p53外显子、外显子和内含子交界区的非编码序列。

1.2.3DHPLC检测基因突变PCR产物不作任何纯化处理，直接用于DHPLC分析。

1.2.4有突变峰型样本DNA片段进行基因测序经DHPLC筛选出来的有突变峰型样本DNA，在相同条件下PCR扩增50 μl产物送测序公司进行DNA的纯化测序。相同的突变峰型只选取一个样本DNA进行测序。

1.3统计分析

应用SPSS 16.0统计软件进行分析，记数资料采用χ2检验。取双侧P，P<0.05为有统计学意义。当N≥40，1≤T<5时，用连续性校正χ2值。N<40或有T<1时，用四格表的确切概率法。

2结果

将658份PCR扩增产物进行DHPLC的筛查，如DHPLC峰型图谱显示为单峰，则表示被检测样品没有发生突变；如DHPLC峰型图谱显示为双峰或多峰，则表示该检测样品有基因异常；如果被检测样品间的异常DHPLC 峰型图谱相同，则表示这些被检测样品之间有相同的基因突变类型。

2.1高、低发区p53基因突变的发生与食管癌生物学行为的关系

两组标本的p53 基因突变与患者性别、年龄及癌肿部位无明显的相关性(P>0.05)，与肿瘤组织分化、临床病理分期和淋巴结转移也无明显的相关性(P>0.05)，见表1。

2.2 高、低发区p53基因突变率的比较

高、低发区p53基因PCR产物突变率比较差异无统计学意义(P=0.816>0.05)，见表2。

高低发区患者基因突变率比较差异无统计学意义(χ2=0.065，P=0.607>0.05)，见表3。

表2　南方高低发区PCR产物突变情况比较/例

表3　南方高低发区患者基因突变情况比较/例

2.3突变基因测序结果

将DHPLC筛查出的有突变峰型病例的相应外显子在相同条件下进行PCR 扩增，扩增出产物50 μL送广州景瑞生物科技有限公司进行纯化测序。同一外显子不同病例间有相同突变峰型的，只选取一个病例的PCR 扩增产物进行纯化测序，共36个样品测序。

在美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站，查找到p53基因全序列(U94788)及p53的密码子序列(CCDS11118.1)，并在NCBI网站将各个样本的测序结果与p53基因全序列及CDS序列分别进行比对。在高发区居民的p53外显子突变谱中，共有14种突变类型，共计41个突变位点，其中最多的突变类型是插入碱基C，共10例；其次为C→T转换，共5例，G→T、T→G转换均为4例。编码区的突变类型有9种，14例，主要以G→T、T→C、G→A转换为主，共计8例，占编码区的突变类型的57.1%。在低发区居民的p53外显子突变谱中，共有10种突变类型，共计35个突变位点，其中最多的突变类型是C→T、T→G转换，各6例；其次为G→C、G→T、G→A转换，各4例。编码区的突变类型有6种，14例，主要以G→T、G→A、C→A转换为主，共计10例，占编码区的突变类型71.4%。

3讨论

食管癌发病率在不同地理区域内有巨大的差异，说明特定的环境因素对其发生起着重要作用。p53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因，在环境致癌物质诱发肿瘤的过程中，p53是最常受累的靶基因之一[2-4]，它的突变与人类50%的肿瘤发生有关[5]。

研究表明，p53基因突变在南方高低发区居民食管癌发生发展中是一个发生频率很高的事件，高发区组和低发区组患者都有p53的突变，p53突变在两组患者中的频率没有明显差别。杨胜利等用同样的方法发现林州居民食管癌中p53突变率为68.3%[6]，与本实验相似，这些提示了高低发区间可能有共同的致p53突变因素在起作用，高、低发区间食管癌的发生可能具有共同的发病机制。食管癌临床病理分期Ⅰ+Ⅱ和Ⅲ+Ⅳ在高发区和低发区中p53阳性率相似，差别无统计学意义。p53基因突变有可能成为预测食管癌变危险性的生物标志，而且在食管癌的发展过程中并未见到p53突变率的显著增高，这说明在食管癌的进程中可能还有其他基因的参与，这与Christian BJ等的结果是一致的[7-8]。

p53是致癌剂作用的靶基因之一，细胞暴露于不同的致癌剂时，常表现为不同的突变谱，SHIGEKO S等对中国河北省的高低发区p53不同突变类型进行了比较，无论是高发区还是低发区，点突变都是最常见的，分别占86.8%和66.7%[9]。甲基苄基亚硝胺(NMBzA)诱发的人胎儿食管癌，NMBzA处理人胎儿食管上皮和NMBzA灌胃猴的食管上皮中发现有Rb、p53、APC和MCC的缺失和突变[10-11]。NMBzA处理的人胎儿食管上皮与猴食管上皮组织中，p53基因突变的指纹均能在人原发性食管癌中找到，在人原发性食管癌40.9%(9/22)的p53突变与NMBzA诱发的p53突变有相同指纹谱，大部分是G→T、G→A转换[12]。用N-戊基-N-甲基亚硝基胺(AMN) 处理后的人食管正常组织标本中，42.19 %(6/14) 检测出p53 基因突变，其中主要的突变亦为G→A转换[13]。本研究发现在高低发区居民的p53 外显子突变以点突变为主。提示了南方高、低发区和上述其他地区的食管癌可能具有相同的环境致癌因素及发病机制，其癌变可能都经历了p53基因突变的过程。机体的遗传物质在环境致癌物N-亚硝基化合物的作用下发生遗传学变异，这在高、低发区食管癌的发生过程中可能起着重要的作用。

引起我们注意的是，为什么发病率差异明显的高、低发区食管癌标本的p53基因突变率会无差异呢？既然高、低发区间食管癌的环境致癌物及发病机制相同，又是什么因素导致两地间的食管癌发病率相差数十倍呢？“氮循环”病因假说[1]提出了有效污染浓度与有效污染比率的概念，解释了上述现象：当人体接触的环境致癌物N-亚硝基化合物及其两类前体物达到有效致癌剂量时便可得癌，而有效污染比例的大小则决定了癌变人群的多少而形成高、低发区。

参考文献

[1]徐致祥编著.农肥、污水与食管癌〔M〕.第1版.北京：科学出版社，2003：1-85.

[2]Lanni JS，Jack T.Characterization of the P53-dependent postmitotic checkpoint following spindle disruption〔J〕.Mol Cell Biol，1998，18(2)：1055-1064.

[3]Uzoam I，Rubenstein M，Mirochnik Y，et al.An evaluation of the markers P53 and Ki-67 for their predictive value in prostate cancer〔J〕.J Surg Oncol，1998，67(1)：33-37.

[4]Martone T，Airoldi L，Magagnotii C，et al.4-Aminobipheny1-DNA adducts and P53 mutations in bladder cancer〔J〕.Int J Cancer，1998，75(4)：512-516.

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[6]杨胜利，谭家驹，徐致祥，等.DHPLC检测林州市高龄组和低龄组居民食管癌p53基因外显子突变谱的比较研究〔J〕.中华肿瘤防治杂志，2007，14(24)：1846-1850.

[7]Christian BJ，Kao C.Wu SQ，et al.Ej/ras neoplastic transformation of simian virus 40-immortalized human uroepithelial cells：a rare events〔J〕.Cancer Res，1990，50(15)：4779-4786.

[8]Strickland JE，Ueda M，Henry H，et al.A model for initiated mouse skin：suppression of papilloma but not carcinoma formation by normal epidomal cells in grafts on athymic nude mice〔J〕.Cancer Res，1992，52(6)：1439-1444.

[9]Sakaguchi S，Yokokawa Y，Hou J，et al.Environmental exposure and p53 mutations in esophageal cancer patients in areas of low and high incidence of esophageal cancer in China〔J〕.Tohoku J Exp Med，2005，207(4)：313-324.

[10]李华川，陆士新，冯骆.NMBzA对猴食管上皮癌基因与多种抑癌基因的作用〔J〕.中国医学科学院学报，1995，17(1)：1-6.

[11]李华川，陆士新，崔晓邢，等.NMBzA对人胎儿食管上皮组织中多种抑癌基因作用的研究〔J〕.中华肿瘤杂志，1995，17(3)：170-174.

[12]李华川，陆士新，崔晓邢，等.人食管癌与NMBzA引起的人和猴食管上皮细胞中多种抑癌基因变化的相关性研究〔J〕.中华肿瘤杂志，1995，17(4)：249-253.

[13]李利亚，唐劲天，刘轩，等.p53 基因在人食管诱发癌中的突变〔J〕.肿瘤防治杂志，2004，11(4)：347-350.

(编辑：吴小红)

Comparative Study on the Mutation Spectrum of p53 Coding Exons in Esophageal

Carcinomas in Southern and Northern China by DHPLC

HONGQiang，TANJiaju，YAOWeishen，etal.NanhaiHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity，Foshan，528200

【Abstract】ObjectiveTo compare the mutation spectrum of p53 coding exons in esophageal carcinomas in southern and northern China by denaturing high performance liquid chromatography(DHPLC).Methods42 and 52 cases of esophageal carcinomas were respectively collected from the high and low risk areas in southern China.The 2-11 coding exons of p53 (including all coding area and part of non-coding area) were amplifyied by PCR after DNA routine extraction.DHPLC was processesd for mutation screening of the products after PCR.Then those with mutations were purified and sequenced of their DNAs.The results were compared with the sequence of wild p53 on NCBI website.The locations of the mutations were confirmed.Information was obtained of the p53 mutations spectrum in the patients from the high and low risk areas.ResultsIn the high risk area group，28 specimens were found with at least 1 coding exon mutations，the p53 mutation rate was 63.8%(28/42)；In the low risk area group，32 pecimens were found with at least 1 coding exon mutations，the p53 mutation rate was 61.5%(32/52)，the difference had no statistic significance between the 2 groups(P=0.881>0.05).ConclusionLow and high risk areas may have a similar range of environmental carcinogens，through the same mechanism of p53 gene mutation leads to the occurrence of esophageal cancer.

【Key words】Esophageal Carcinoma；Denaturing high performance liquid chromatography(DHPLC)；Gene mutation

(收稿日期2014-04-29修回日期 2014-09-30)

中图分类号：R735.1

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2015)01-0039-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.01.011