Ebp1的表达对乳腺癌细胞增殖和侵袭的影响

刘 媛，袁 杰，张 洁，赵元元，牛瑞芳

（天津医科大学肿瘤医院肿瘤研究所，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室，天津300060）

论著

Ebp1的表达对乳腺癌细胞增殖和侵袭的影响

刘 媛，袁 杰，张 洁，赵元元，牛瑞芳

（天津医科大学肿瘤医院肿瘤研究所，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室，天津300060）

目的：研究降低Ebp1的基因表达水平对乳腺癌细胞T47D野生型增殖能力和侵袭能力的影响。方法：转染并筛选Ebp1降表达的单克隆细胞株clone1、clone2、clone3，阴性对照组命名为control。应用小干扰RNA（siRNA）技术降低Ebp1的表达，采用Western blotting技术检测Ebp1蛋白水平的变化,噻唑蓝（MTT）比色法和克隆形成实验观察其对T47D野生型细胞增殖能力和克隆形成能力的影响;采用Matrigel侵袭实验研究其对细胞侵袭能力的影响。结果：Western blotting检测表明siRNA干扰后T47D野生型细胞中Ebp1的蛋白表达水平明显下降,且与亲本和control组细胞比较，Ebp1降表达的细胞克隆的增殖能力和侵袭能力明显增强，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：Ebp1表达下降可以明显促进乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力，提示Ebp1可能是乳腺癌增殖和侵袭的抑制性因子。

Ebp1；乳腺癌；增殖；侵袭

乳腺癌是女性发病率最高的肿瘤之一，而肿瘤的浸润和转移是影响治疗效果和导致死亡的重要因素[1]。Ebp1是重组人增殖相关蛋白2G4（proliferation-associated 2G4）家族的成员之一，最早是通过酵母双杂交从生长因子表皮受体3（EGFR3）的跨膜区域分离得到，并且被鉴定为ErBb3的结合蛋白[2]。Ebp1在乳腺癌[3]、肝癌[4]、前列腺癌[5]等多种肿瘤细胞中表达异常，参与调节细胞周期和细胞分化，是肿瘤增殖抑制因子。蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）可引起Ebp1的Ser360的磷酸化与ErbB3发生结合，而当在ErBb3配体HRG的刺激下[6]，Ebp1与ErBb3分离进入细胞核，与转录抑制因子Rb[7]、组蛋白脱乙酰酶HDAC2[8]、转录抑制因子Sin3A[9]相互作用，形成转录抑制复合体，从而导致与增殖相关的蛋白如转录因子E2F1、周期蛋白Cyclin D1和Cyclin E的表达受到抑制。目前Ebp1在乳腺癌中的研究已证实其对乳腺癌细胞MCF-7和AU565增殖的抑制作用[10]，但是其对乳腺癌迁移和侵袭的研究却较少。本研究利用小干扰RNA（siRNA）技术降低增殖能力和侵袭能力都较弱的乳腺癌细胞T47D野生型中的Ebp1表达，观察降表达后对T47D野生型细胞的增殖和侵袭能力的影响，探究Ebp1影响乳腺癌增殖和侵袭的分子机制。

1 材料和方法

1.1 siRNA质粒 Ebp1特异性小干扰RNA购自吉凯基因公司，干扰序列为：5′-ATGCAGGACAGAGAACCACTATTTACA-3′，对照组序列为：5′-ATGCCAGCCAGGGAGAGTACAAGGCA-3′[11]，质粒的测序结果显示与定制序列一致。

1.2 细胞培养 人乳腺癌细胞T47D野生型（American Type Culture Collection细胞库）培养于含有10%FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMl-1640培养液，37℃、5%CO2环境中，0.25%的胰酶消化传代。

1.3 细胞系的建立

1.3.1 质粒转染 （1）取对数生长期的T47D野生型细胞以适当密度接种于6孔板内，使其24 h覆盖率达到90%～95%，37℃、5%CO2孵箱培养。（2）24 h后用1640培养液将细胞饥饿2 h，以提高转染效率。（3）将siRNA及对照质粒（序列长度与siRNA相同却无干扰意义）用Lipofectamine2000（Invitrogen公司）进行转染。取质粒10μg，转染试剂4μL分别稀释于1640培养液，静置20min后混匀，缓慢滴加到6孔板内，37℃、5%CO2孵箱培养。（4）转染6 h后更换新鲜培养液。

1.3.2 稳定克隆的筛选 （1）转染48 h后在荧光显微镜下观察细胞转染效率，并加入150mg/mL的嘌呤霉素进行筛选，期间依据细胞状态和密度进行换液或传代。（2）筛选2周后，观察细胞荧光强度，并以有限稀释的方法筛选出3珠稳定单克隆细胞，分别命名为 clone1、clone2、clone3，对照组命名为control组，嘌呤霉素浓度为筛选浓度的1/2。（3）siRNA的干扰效率以Western blotting检测。

1.4 Western blotting检测Ebp1在细胞中的表达将提取的细胞蛋白用SDS-PAGE胶电泳分离并转移至PVDF膜上。5%牛奶封闭1 h后室温孵育一抗Ebp1（1∶1 000）（Mi lipore兔抗），β-acti n（1∶2 000）（Santa Cruz鼠抗）2 h，室温孵育HRP标记的二抗（1∶5 000）（Invit rogen公司）1 h；最后用ECL化学发光试剂和胶片曝光信号检测蛋白的表达水平。

1.5 噻唑蓝（MTT）检测细胞增殖能力 取对数生长期的T47D野生型细胞、control细胞和clone1、clone2、clone3分别接种于96孔板中,贴壁后每24 h加入20μL的5mg/mLMTT，继续孵育4 h后每孔加150μL二甲基亚砜（DMSO），酶标仪测量570 nm处的吸光度（OD值），连续检测5d，每种细胞设置5个复孔，取其OD值的平均值。

1.6 克隆形成实验检测细胞克隆形成能力 取对数生长期的 T47D野生型细胞、control细胞和clone1、clone2、clone3，分别以500个/孔接种于6孔板中，37℃、5%CO2培养2周，每3～4 d更换新鲜培养液。2周后，弃去培养液，用甲醇固定10min，0.000 5%结晶紫染色30min，显微镜下观察并计数克隆形成数目，以>50个细胞为1个克隆。

1.7 Matrigel侵袭实验检测细胞的侵袭能力 将Matrige l（BD公司）在4℃缓慢解冻后与无血清的DMEM培养基以1∶4的比例稀释，加入T ranswell（24孔），50μL/孔，放入37℃温箱30min。将150μL的T47D野生型细胞、control细胞和clone1、clone2、clone 3细胞悬液加入上室，细胞浓度为5×105个/ mL，将300μL血清加入下室。37℃、5%CO2的细胞培养箱中培育24～36 h。利用三步染色试剂盒染色。在倒置显微镜下计数过膜细胞，光镜下（200×）随机选择5个视野计数取平均值。

2 结果

2.1 质粒转染效率验证 转染48 h后siRNA及对照质粒的转染效率如图1所示，siRNA及control组转染效率都在60%以上。clone1、clone2、clone3经过嘌呤霉素筛选后荧光细胞比例高达95%～100%，证明转染及筛选成功。

图1 干扰质粒及对照质粒的转染效率Fig1 The transfection efficiency of sm all interference plasm id and control

2.2 siRNA干扰T47D野生型细胞中Ebp1的表达水平 Western blotting结果显示，与T47D野生型比较，应用特异性小干扰RNA处理挑取的3个克隆细胞株中Ebp1表达量明显降低，而对照组则没有差异（图2）。

图2 W estern blotting检测Ebp1的表达Fig 2 Theexpression of Ebp1 detected by western blotting

2.3 降表达Ebp1增强T47D野生型细胞的增殖能力 用MTT法分别检测T47D野生型、control组和clone1、clone2、clone3细胞在 0、24、48、72、96 h的OD值，绘制生长曲线图（图3），结果显示稳定细胞系在72、96 h的生长速度明显高于T47D野生型和control组细胞（P＜0．05），而T47D野生型和对照组细胞间的增殖差异无统计学意义（P＞0．05）。证明Ebp1的蛋白水平降低对T47D野生型细胞的增殖具有明显促进作用。

图3 实验组和对照组细胞的生长曲线Fig 3 The proliferation grow th curves of T47D wild type,control, clone1,clone2 and clone3 cells

2.4 降表达Ebp1促进T47D野生型细胞的克隆形成能力 克隆形成计数结果显示，与T47D野生型和对照组比较，clone1、clone2、clone3细胞的克隆数目明显增多（图4），且差异有统计学意义（P<0.05），而对照组与T47D野生型之间无明显差异（P>0.05），克隆直径也有明显的增加。表明降低Ebp1的蛋白表达提高了乳腺癌细胞系T47D野生型的克隆形成能

图4 各组细胞的克隆形成数目Fig 4 The colony num ber of T47D and cloneswhich down-regulated of theexpression of Ebp1

2.5 降表达Ebp1提高T47D野生型细胞的侵袭能力 T47D野生型和control组细胞穿透Matrigel的细胞数目明显低于clone1、clone2、clone3细胞,且差异有统计学意义（P＜0．05）。而T47D野生型组与control组比较无明显差异（P＞0.05），结果显示干扰Ebp1的基因表达明显提高了T47D野生型细胞的侵袭能力（图5）。

图5 干扰Ebp1促进T47D细胞的体外侵袭能力（×200）Fig 5 The deletion of Ebp1 result in the increaseof invasion ability of T47D cells（×200）

3 讨论

目前乳腺癌的治疗手段主要是手术、放化疗，但是预后的效果却并不理想，这主要是由于肿瘤的浸润和转移，因此研究乳腺癌浸润和转移的分子机制对于提高治疗效果意义重大[12]。此外，肿瘤细胞的恶性增殖的分子机制也是目前探究肿瘤治疗的热点。Ebp1，ErbB3结合蛋白之一，被证实是肿瘤的抑制因子，其发生核转位后与Rb、Sin3A、HDAC2形成转录抑制复合体，对肿瘤的增殖和迁移有重要的影响。研究报道，Ebp1在ErBb2/3阳性的乳腺癌细胞AU565中的表达明显增高，导致细胞G2/M期阻滞和分子分化，是乳腺癌增殖的抑制因子[10]。但是，Ebp1对乳腺癌浸润转移的影响尚不明确，因此，本研究着重研究了Ebp1对非浸润性乳腺癌细胞系T47D野生型的增殖和侵袭能力的影响。

Ebp1在肝癌、前列腺癌、乳腺癌等肿瘤组织中表达均降低，降表达后肿瘤细胞的增殖能力显著增强，本文我们特异性干扰T47D野生型细胞中Ebp1的蛋白表达量，MTT实验结果和克隆形成实验结果都表明Ebp1降表达后T47D野生型的增殖能力有明显的增强作用，说明Ebp1是乳腺癌增殖的抑制因子。但是，我们又发现，干扰Ebp1的基因表达水平后，T47D野生型细胞的侵袭能力也有明显地提高。研究报道在唾液腺样囊性癌转移病灶包括淋巴、肺和神经组织中Ebp1含量低于原发病灶，表明Ebp1与肿瘤细胞的迁移呈负相关[13]，同样的结论在肝癌[14]、前列腺癌[15]等肿瘤中也得到证实。我们的研究也证明在乳腺癌中Ebp1的降表达促进肿瘤的迁移和侵袭。在腺样囊性癌中证实Ebp1与MMP-9（金属蛋白酶9）和E-cadherin的表达呈负相关[13]，因此推测Ebp1影响T47D野生型细胞的迁移和侵袭可能通过MMPs的激活和上皮间质转化，但是需要进一步的研究证实。

综上所述，本研究证实Ebp1的表达量下降后导致乳腺癌细胞增殖和侵袭能力增强，而其中的分子机制尚不明确。但是，Ebp1对乳腺癌的影响为探究肿瘤的发生发展以及治疗提供了新的思路。

[1]Zheng H,LiY,Wang Y Z,etal.Downregulation ofCOX-2 and CYP 4A signaling by isoliquiritigenin inhibits human breast cancer metastasis through preventing anoikis resistance,migration and invasion[J].Toxicol ApplPharmacol,2014,280(1)：10

[2] Yoo JY,Wang X W,Rishi A K,et al.Interaction of the PA2G4 (EBP1)proteinwith ErbB-3 and regulation of thisbindingby heregulin[J].Br JCancer,2000,82(3)：683

[3]Lu Y,Zhou H,ChenW,etal.The ErbB3 bindingprotein EBP1 regulates ErbB2 protein levels and tamoxifen sensitivity in breast cancer cells[J].BreastCancer Res Treat,2011,126(1)：27

[4] Hu B Y,Xiong Y C,Ni R Z,et al.The downregulation of ErbB3 binding protein 1(EBP1)isassociated with poor prognosisand enhanced cell proliferation in hepatocellular carcinoma[J].Mol Cell Biochem,2014,396(1/2)：175

[5] Zhang Y,Linn D,Liu Z,etal.EBP1,an ErbB3-binding protein,is decreased in prostate cancer and implicated in hormone resistance [J].MolCancer Ther,2008,7(10)：3176

[6] Liu ZX,Ahn JY,Liu X,etal.Ebp1 isoforms distinctively regulate cellsurvivaland differentiation[J].Proc Natl Acad SciU SA,2006, 103(29)：10917

[7] Zhang Y,Woodford N,Xia X,et al.Repression of E2F1-mediated transcription by the ErbB3 binding protein Ebp1 involves histone deacetylases[J].Nucleic AcidsRes,2003,31(8)：2168

[8]Akinmade D,Lee M,Zhang Y X,etal.Ebp1-mediated inhibition of cell growth requires serine 363 phosphorylation[J].Int JOncol, 2007,31(4)：851

[9]Ghosh A,AwasthiS,Hamburger AW.ErbB3-binding protein EBP1 decreases ErbB2 levels via a transcriptionalmechanism[J].Oncol Rep,2013,29(3)：1161

[10]Zhang Y X,Akinmade D,Hamburger AW.Inhibition of heregulin mediated MCF-7 breast cancer cell growth by the ErbB3 binding protein EBP1[J].Cancer Lett,2008,265(2)：298

[11]Kim CK,Nguyen TL,Joo KM,etal.Negative regulation ofp53 by the long isoform of ErbB3 binding protein Ebp1 in brain tumors[J]. Cancer Res,2010,70(23)：9730

[12]Chen JJ,Peck K,Hong TM,et al.Global analysis of gene expression in invasion by a lung cancermodel[J].Cancer Res,2001,61 (13)：5223

[13]Sun J,Luo Y X,Tian Z,etal.Expression of ERBB3 binding protein 1(EBP1)in salivary adenoid cystic carcinomaand its clinicopathological relevance[J].BMCCancer,2012,12：499

[14]Zhang Y X,Ali T Z,Zhou H,et al.ErbB3 binding protein 1 repressesmetastasis-promoting gene anterior gradient protein 2 in prostate cancer[J].Cancer Res,2010,70(1)：240

（2014－08－11收稿）

Influence of the expression of Ebp1 on the proliferation and invasion of breast cancer cells

LIUYuan,YUAN Jie,ZHANG Jie,ZHAOYuan-yuan,NIURui-fang
（Cancer Instituteand Hospital Tianjin Medical University,NationalCancer ClinicalMedicine Research Center，Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therapy,Tianjin 300060,China）

Objective：Tostudy the influenceof theexpression ofEbp1 on theproliferation and invasion ofbreastcancer cells.Methods：Western blotting and siRNAwere applied to inspectand down-regulate the expression of Ebp1.The effectofproliferation and invasion of T47Dwild type cellswasexamined by MTT assay,colony formation assay and transwellassay respectively.Results:The proliferation and invasion of T47D wild type could be promoted by knock-down of Ebp1 as compared towild type group and control group（P＜0.05）.Conclusion:Down-regulation of Ebp1 facilitates the proliferation and invasion ofbreast cancer cellswhich suggest thatEbp1may be an inhibiting factor forbreastcancer.

Ebp1;breastcancer;proliferation;invasion

R737.9

A

1006－8147（2015）01-0014-04

刘媛（1987-），女，硕士在读，研究方向：乳腺癌增殖和侵袭的分子机制研究；通信作者:牛瑞芳，E-mail:niurfl982@yahoo. com.cn。