线粒体ATP敏感性钾通道开放对大鼠肺缺血-再灌注损伤的保护作用*



线粒体ATP敏感性钾通道开放对大鼠肺缺血-再灌注损伤的保护作用*

**通信作者 E-mail:mzlcf2008@126.com

网络出版时间：2015-04-20网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150420.1829.003.html

李涛1， 赖春凤2**， 曾茂森1， 陆德琴3

(1.嘉应学院医学院 病理学与病理生理学教研室， 广东 梅州514031； 2.嘉应学院医学院 内科学教研室， 广东 梅州514031； 3.贵阳医学院 病理生理学教研室， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 探讨线粒体ATP敏感性钾通道(mitoKATP)开放对大鼠肺缺血-再灌注损伤(I/R)的保护作用。方法： 建立大鼠肺I/R模型，设立假手术组、肺I/R组、mitoKATP开放剂二氮嗪(DE)+I/R组、mitoKATP阻断剂5-羟基葵酸(5-HD)+DE+I/R组，每组10只大鼠；检测各组肺组织湿/干重比，HE染色法观察各组肺组织形态学变化，免疫组织化学染色法检测肺组织细胞色素C的表达，TUNEL法检测肺细胞凋亡指数。结果： 与假手术组相比，I/R组肺组织湿/干重比明显增加(P<0.05)，肺组织出现出血、水肿等损伤性病理学变化，细胞色素C表达明显增多(P<0.01)、肺细胞凋亡指数明显增大(P<0.01)；与I/R组相比，DE+I/R组肺组织湿/干重比明显降低(P<0.05)、肺组织损伤性病理变化明显减轻、肺细胞色素C表达明显减少(P<0.05)、细胞凋亡指数明显减小(P<0.05)，而5-HD+DE+ I/R组各项指标与I/R组比较无差异(P>0.05)。结论： mitoKATP的开放可减轻肺水肿、抑制细胞凋亡，对大鼠肺缺血-再灌注损伤具有保护作用。

[关键词]肺；缺血；再灌注损伤；线粒体ATP敏感性钾通道；细胞凋亡；大鼠，Sprague-Dawley

近年来，随着体外循环技术的广泛应用，肺缺血-再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，I/R)所导致的肺功能障碍受到重视。低氧或缺血预处理(hypoxic/ischemic preconditioning，HPC/IPC)是抗脏器I/R有效防治手段之一，而线粒体ATP敏感性钾通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channel，mitoKATP)被认为是IPC的触发因子和后期保护作用的终末效应因子。mitoKATP开放对低氧性肺损伤具有保护作用。本实验观察mitoKATP开放预处理对大鼠肺I/R的保护作用及其机制，为I/R的机制及其防治提供实验依据。

1材料与方法

1.1　材料

1.1.1实验动物成年SD大鼠40只，体质量180~210 g，雌雄不拘，由汕头大学动物实验中心提供。常规饮食，自由饮水。

1.1.2主要试剂及仪器mitoKATP开放剂二氮嗪(DE，sigma公司)、阻断剂5-羟癸酸(5-HD，sigma公司)；细胞凋亡检测试剂盒(TUNEL法)、链酶亲和素-生物素-过氧化物酶法(SABC法)试剂盒、DAB显色试剂盒、细胞色素C抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司)，CMS显微镜(日本Leica)，BX41图像采集系统(日本OLYMPUS)。

1.2　方法

1.2.1大鼠肺I/R模型复制10%水合氯醛0.2 mL/100 g腹腔麻醉，气管插管，接动物呼吸机。经左前胸第5肋间开胸，解剖左侧肺门，用盐水稀释肝素50 U至500 μL经尾静脉注入，5 min后于肺充盈末用手术丝线通过肺门双活结套扎左肺门，45 min后开放，再灌注120 min。假手术组左肺门穿线不结扎。实验结束后切取左肺备用。

1.2.2实验分组(1)假手术组：开胸后游离左肺门，穿线不结扎，不进行其他处理。(2)I/R组：用手术丝线通过肺门双活结套扎左肺门，45 min后开放，再灌注120 min。(3)DE+I/R组：在缺血前30 min腹腔注入DE 10 mg/kg后，按(2)进行处理。(4)5-HD+DE+I/R组：先给予5-HD 10 mg/kg静脉注射，15 min后给予DE 10 mg/kg腹腔注入，30 min后再按(2)处理。以上4组每组10只。

1.2.3标本的采集和处理实验结束时，取出大鼠左肺，切取中下段肺组织，置于新鲜10%中性缓冲福尔马林中固定24 h，常规石蜡包埋切片，供HE染色、免疫组织化学染色及细胞凋亡检测。

1.2.4肺组织细胞色素C免疫组织化学(SABC法)检测。切片置3% H2O2去除内源性过氧化酶，柠檬酸盐缓冲液中中高火进行抗原修复，滴加1∶120的一抗过夜后加入山羊抗兔IgG，DBA显色，细胞浆呈棕黄色判定为细胞色素C阳性表达。于400×显微镜下随机取5个细胞总数超过200的视野，计数阳性细胞数及细胞总数，计算阳性细胞率(阳性细胞数/细胞总数×100%)。

1.2.5肺细胞凋亡TUNEL法检测。在普通光学显微镜下凋亡细胞的细胞核呈现棕黄色判定为阳性细胞，无细胞凋亡不显色则为阴性。在400×倍显微镜下任取5个细胞总数200个以上的视野，计数阳性细胞数及细胞总数，并计算细胞凋亡指数(阳性细胞数/细胞总数×100%)。

1.3　统计学方法

2结果

2.1　形态学观察

光镜下，可见假手术组肺泡腔内无水肿、充血及坏死，间隔无增宽，无炎细胞浸润，结构清晰可见(图1-A)。I/R组肺泡腔内可见明显的充血、水肿，血管扩张及炎细胞浸润，并有局灶性肺气肿，肺泡间隔增宽，偶见局灶性的坏死灶，组织、细胞结构紊乱(图1-B)。DE+I/R组可见少量的炎性细胞浸润，无明显的充血、水肿，组织、细胞损伤程度较I/R组明显减轻，与对照组相似(图1-C)。而5-HD+DE+I/R组亦可见明显 的充血、水肿，肺气肿及炎性细胞浸润等，表现出近似I/R组的病理改变(图1-D)。

2.2　肺组织湿/干重比

与假手术组相比，I/R组及5-HD+DE+I/R组肺湿/干比显著增大，差异有统计学意义(P<0.01)，而DE+I/R组差异无统计学意义(P>0.05)；与I/R组相比，DE+I/R组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明mitoKATP开放剂能够减轻肺组织损伤，减轻肺水肿，而使用mitoKATP抑制剂后可阻断此保护作用。见表1。

表1　各组大鼠肺组织湿/干重比的变化±s)

(1)与假手术组比较，P<0.05；(2)与I/R组比较，P<0.05

2.3　肺组织细胞色素C和凋亡指数

I/R组及5-HD+DE+I/R组肺组织细胞色素C的阳性细胞率均高于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；与I/R组相比，DE+I/R组阳性细胞率明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)，而5-HD+DE+I/R组差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图1。假手术组大鼠的肺组织仅偶见细胞凋亡的发生，I/R组及5-HD+DE+I/R组肺细胞凋亡指数均显著高于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)；与I/R组相比，DE+I/R组肺细胞凋亡指数明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、图2。

3讨论

I/R普遍发生于各个组织器官，大量实验证明与假手术组比较，(1)P<0.01，(2)P<0.05；(3)与I/R组比较，P<0.05I/R可加重心、脑、肾、肠、肺等器官损伤，是影响缺血治疗效果的一个重要因素。再灌注损伤发病机制复杂，氧自由基的作用、钙超载、中性粒细胞、细胞凋亡和补体激活等均可能参与了再灌注损伤的发病过程[3-4]。肺I/R常常发生于心肺复苏、体外循环、肺栓塞、肺切除、肺移植等情况下，是影响术后肺组织功能恢复的关键性因素。肺I/R后病理改变主要是肺泡-毛细血管通透性增高，中性粒细胞渗出、蛋白漏出、肺间质与肺泡水肿，肺湿/干比增加，组织炎症与细胞损伤，以及肺细胞凋亡与坏死等，从而导致肺功能明显降低。本实验结果显示肺经I/R后，光镜下可见肺泡腔内可见明显的出血、水肿，炎性细胞浸润，组织、细胞结构紊乱，肺组织损伤明显；肺湿/干重比较假手术组明显增高。

表2　各组肺组织细胞色素C阳性

实验和临床资料表明，HPC/IPC是减轻脏器I/R的有力防治措施，研究大多涉及心脏和脑组织，在本课题组之前的研究中也表明HPC对大鼠肺缺血再灌注损伤有保护作用，认为是细胞线粒体释放了细胞色素C，抑制细胞凋亡从而保护肺I/R损伤[6-8]。

研究表明，在低氧HPC对抗低氧性肺损伤的保护作用机制中线粒体ATP敏感性钾通道起到了重要的作用，研究中发现mitoKATP的开放剂DE可以提高肺泡液体清除率，减轻肺水肿和肺损伤，而特异性抑制剂5-HD和格列苯脲可以阻断DE的保护作用。提示mitoKATP的开放对肺I/R也具有保护作用。为了进一步验证这一观点，本研究应用DE进行HPC/IPC，实验结果发现，DE对肺I/R有明显的保护作用，与I/R组相比，光镜下可见肺损伤性病理形态学改变明显减轻，肺/干重比明显下降。当应用5-HD关闭mitoKATP后，与DE组相比，光镜下肺组织损伤加重，肺湿/干重比明显升高。实验表明DE能够减轻I/R所引起的肺损伤、肺水肿，5-HD有阻断DE的作用加重肺损伤。

A为假手术组，B为I/R组，C为DE+I/R组，D为5-HD+DE+I/R组图1　肺组织细胞色素C表达(SABC,×400)Fig.1　Expression of cytochrome C in rat lung tissues of different groups (SABC,×400)

A为假手术组，B为I/R组，C为DE+I/R组，D为5-HD+DE+I/R组图2　肺组织细胞凋亡( TUNEL, ×400)Fig.2　Lung tissue sections of different groups showing different amount of apoptosis cells(TUNEL,×400)

实验还发现，肺I/R后肺组织细胞色素C的阳性表达率明显增加，肺细胞凋亡指数也明显增加，DE预处理可显著降低肺组织细胞色素C的阳性表达率和细胞凋亡指数，而预先应用5-HD后则肺组织细胞色素C阳性表达率增加，肺组织细胞凋亡明显，且与I/R组相比无显著性差异。这可能是由于DE引起mitoKATP开放和线粒体膜电位Δψm部分去极化，减少了细胞色素C从线粒体释放入胞浆，从而减少肺动脉平滑肌细胞的凋亡发生。

综上所述，mitoKATP的开放可以减轻肺I/R所致的肺损伤、肺水肿，还可通过抑制线粒体细胞色素C释放至胞浆、抑制肺组织细胞凋亡对肺I/R损伤的发挥保护作用。

4参考文献

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[6] 李涛,陈莹,陆德琴,等.大鼠整体低氧预处理减轻肺缺血再灌注损伤[J].贵阳医学院学报, 2008(6):632-634,639.

[7] 陈莹,陆德琴,李涛,等.整体低氧预处理对大鼠肺组织细胞色素C表达和细胞凋亡的影响[J].贵阳医学院学报, 2009(5):504-507.

[8] 陆德琴,陈莹,李涛,等.大鼠整体低氧预处理对在体肺缺血再灌注损伤的保护作用[J].重庆医学, 2010(15):1960-1962.

(2015-01-05收稿，2015-02-25修回)

中文编辑： 吴昌学； 英文编辑： 刘华

Protective Effects of Opening of Mitochondrial ATP Sensitive Potassium

Channel on Ischemia-reperfusion Injury in Rat Lunginvivo

LI Tao1, LAI Chunfeng2, ZENG Maosen1, LU Deqin3

(1.DepartmentofPathologyandPathophysiology,MedicalCollegeofJiayingCollege,Meizhou514031,Guangdong,China;

2.DepartmentofInternalmedicine,MedicalCollegeofJiayingCollege,Meizhou514031,Guangdong,China;

3.DepartmentofPathophysiology,GuiyangMedicalCollege，Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the protective effect of opening of mitochondrial ATP sensitive potassium channel on lung ischemia-reperfusion injury in rats. Methods: Pulmonary ischemia-reperfusion injury rat model was established by left hilar ligation and reperfusion. Preconditioning was conducted by using the mitochondrial ATP sensitive potassium channel opener (diazoxide, DE). Forty rats were randomly divided into four groups (n=10, respectively), i.e. sham-operation group, I/R group, DE+I/R group and 5-HD+DE+I/R group. The ratio of wet/dry weight of lung tissue and morphological change were observed. Cytochrome C expression and apoptosis index in lung tissue were assessed by immunohistochemical staining and TUNEL methods, respectively. Results: Compared with sham-operation group, the wet/dry weight ratio of lung tissue in I/R group was significantly increased(P<0.05), the pathological changes such as hemorrhage and edema in lung tissue, the expression of cytochrome C increased significantly(P<0.01) and the lung cell apoptosis index increased significantly. Compared with I/R group, the wet/dry weight ratio of lung tissue in DE+I/R group was significantly decreased(P<0.05), the pathological changes in lung tissue were obviously alleviated, the expression of cytochrome C decreased significantly(P<0.01) and the lung cell apoptosis index decreased significantly(P<0.01). There was no difference in above-mentioned indexes between I/R group and 5-HD+I/R group(P>0.05). Conclusion: The opening of mitochondrial ATP sensitive potassium channel can effectively alleviate pulmonary edema, inhibit apoptosis and play a protective role in the injury of lung ischemia-reperfusion in vivo.

[Key words]lung; ischemia； reperfusion injury; mitochondrial ATP sensitive potassium channel；apoptosis; rats，Sprague-Dawley

[中图分类号]R363.1

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2015)04-0356-04

*[基金项目]广东省梅州市科技局计划项目(2007B17)