DM大鼠肾组织Id2蛋白表达变化与纤维化病变发生发展关系的研究*



DM大鼠肾组织Id2蛋白表达变化与纤维化病变发生发展关系的研究*

**通信作者 E-mail:yxhx20060725@126.com

网络出版时间：2015-04-20网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150420.1840.009.html

文箐颍， 苏博， 肖瑛**， 王圆圆， 李霜， 刘丽荣， 石明隽， 郭兵

(贵阳医学院 病理生理学教研室， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 动态观察分化抑制因子2(Id2)在糖尿病大鼠血糖控制前后肾小管上皮细胞的表达变化，探讨其在肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化过程(EMT)中可能发挥的作用。方法： 雄性SD大鼠随机分为正常对照组(N)、糖尿病组(DM)，糖尿病胰岛素治疗组(DMT)，采用链脲佐菌素(55 mg/kg)尾静脉注射复制Ⅰ型糖尿病大鼠模型，N组和DM组成模后分别于2周(2 w)、8周(8 w)、16周(16 w)、24周(24 w)时各处死6只；成模13周(13 w)起，DMT组大鼠采用胰岛素个体化治疗，以血糖控制在4~7 mmol/L,尿糖阴性为准，分别于16 w和24 w时处死6只大鼠；观察大鼠血糖、24 h尿蛋白并计算肾脏指数，HE、PAS染色光镜下观察肾组织结构的变化，免疫组化观察大鼠肾脏纤维连接蛋白(FN)的蛋白表达情况，Western blotting检测大鼠肾组织分化抑制因子(Id2)、E-钙粘素(E-cadherin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白变化，RT-PCR检测肾组织Id2 mRNA表达情况。结果： (1)与N组相比，不同时间点DM组血糖、24 h尿蛋白量、肾脏指数均显著升高(P<0.01)，并出现肾组织形态学异常改变；而DMT组血糖、24 h尿蛋白量、肾脏指数均低于DM组(P<0.05)，肾纤维化病变改善；(2)与N组比较，DM组肾组织Id2蛋白和mRNA的表达从2 w开始减少，16 w、24 w显著减少(P<0.05)，并伴有E-cadherin的表达减少(P<0.05)、α-SMA表达增加(P<0.05)和FN蛋白的沉积增多(P<0.05)，相关性分析显示Id2蛋白与FN蛋白成负相关(r=-0.931,P<0.05)，与E-cadherin蛋白成正相关(r=0.900 0, P<0.05)；(3)与DM组相比，DMT组大鼠肾组织Id2蛋白和mRNA表达均明显增加(P<0.05)，且E-cadherin的表达增加(P<0.05)、α-SMA的表达及FN在间质沉积减少(P<0.05)。结论： 胰岛素在控制血糖能上调肾小管上皮细胞Id2蛋白的表达，恢复Id2对肾纤维化的负调节作用，进而逆转肾小管上皮细胞的EMT及减轻肾间质ECM的沉积，改善DN肾纤维化病变。

[关键词]糖尿病肾病; 纤维化； 分化抑制因子2； 纤维连接蛋白； E-钙黏素； α-平滑肌肌动蛋白； 大鼠，Sprague-Dawley

越来越多的证据表明，肾小管上皮细胞向间质细胞转分化(epithelial- mesenchymal transition, EMT)是肾间质纤维化发生、发展的主要机制之一，也是DN肾小管间质纤维化的主要原因[1-2]，故抑制或逆转EMT对延缓DN病情发展具有重要的意义。EMT过程涉及多种细胞事件和分子介质的参与和相互作用，影响因素众多且作用复杂，故对其分子机制的认识仍不甚清楚。分化抑制因子2或DNA结合抑制因子2(inhibitors of differentiation or inhibitors of DNA binding)属于螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix, HLH)转录因子家族，是一种广泛存在于哺乳动物细胞中的核转录因子的负调控蛋白。研究发现，Id2蛋白除具有抑制细胞分化、促进细胞增殖作用、诱导细胞凋亡、维持细胞存活、促进血管形成等作用外，Id2蛋白与一些脏器纤维化有关，如肝纤维化、肺纤维化、晶状体等且可能有抑制EMT发生的作用。目前对于在DN肾脏纤维化过程中Id2与EMT的关系及Id2蛋白表达的动态变化，研究报道尚少。因此，本研究动态观察分化抑制因子Id2蛋白在糖尿病大鼠肾组织中的表达变化及胰岛素控制血糖后对Id2蛋白表达和纤维化病变的影响，初步探讨Id2负调节肾纤维化的作用及可能机制。

1材料与方法

1.1　材料

1.1.1实验动物雄性清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重180~220 g，购于北京华阜康生物科技投资有限公司，动物批号SCXK(京)2009-0004。大鼠在清洁条件下适应性饲养，大鼠两次尿蛋白和尿糖定性均为阴性，空腹血糖4.0~7.0 mmol/L。

1.1.2主要试剂链脲佐菌素(STZ, Sigma公司,美国)，Id2兔多克隆抗体(Santa Cruze公司, 美国)，E-钙粘蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(FN)(博奥森公司,北京)，β-actin 单克隆抗体、DAB显色剂(博士德公司, 武汉)，免疫组化SP两步法检测试剂(中杉金桥公司,北京)，PVDF膜、Whatman 3MM滤纸(Millipore公司,美国)，RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas,立陶宛)，超敏ECL化学发光试剂盒(碧云天生物研究所,北京)，总RNA提取试剂盒、2×Taq PCR MasterMix、Marker(天根生化科技有限公司,北京)，Id2、β-actin引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)。

1.2　实验方法

1.2.1动物模型及分组60只大鼠随机分为正常对照组(N组)、糖尿病组(DM)组和糖尿病胰岛素治疗组(DMT)组,DM组大鼠按55 mg/kg剂量尾静脉注射溶于pH4.5、0.01 mol/L无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的STZ，48 h后测空腹血糖，血糖≥16.7 mmol/L、且尿糖阳性大鼠认为造模成功；正常对照组于大鼠尾静脉注射无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(STZ溶媒)，N组和DM组分别取6只大鼠于成模后2周(2 w)、8周(8 w)、16周(16 w)、24周(24 w)处死；DMT组大鼠在DM成模13周(13 w)起采用胰岛素个体化治疗，以血糖控制在4~7 mmol/L，尿糖阴性为准，分别于16 w和24 w时各处死6只大鼠。所有大鼠予标准饲料喂养，自由饮水。

1.2.2血、尿及肾脏标本的采集处死前1 d代谢笼收集24 h尿液，记录尿量。禁食6~8 h，麻醉后称重，股动脉放血，收集血液，4 ℃离心，分离血清，-20 ℃保存；处死大鼠，开腹取胰腺和肾脏，胰腺及一侧肾脏固定于中性甲醛供制作石蜡切片用，另一侧肾脏于-80 ℃冰箱保存供Western blotting和RT-PCR检测。

1.2.3生化指标测定全自动生化分析仪检测血清葡萄糖浓度，考马斯亮蓝法测尿蛋白，按试剂盒说明书操作。尿蛋白浓度与尿量乘积为24 h尿蛋白量。

1.2.4肾组织形态学观察中性甲醛固定的肾脏组织制成3 μm厚的石蜡切片，HE和PAS染色光镜下观察肾组织形态结构的变化。以肾重(mg)与体重(g)比值作为肾脏指数。

1.2.5肾组织中FN蛋白的表达免疫组织化学SP法检测肾组织中FN蛋白的表达。常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，微波抗原修复，正常羊血清工作液封闭，滴加FN一抗4 ℃，PBS冲洗3×5 min，滴加生物素标记二抗,DAB显色，苏木素复染；结果判定：显微镜测微尺(0.5网形目镜尺)下10个高倍(×400)视野内十字交叉点与阳性染色重合的点数，取均值代表FN的表达程度。

1.2.6肾组织Id2、E-cadherin和α-SMA蛋白的表达Western印迹法检测肾组织Id2、E-cadherin和α-SMA蛋白的表达。取-80 ℃保存的各组大鼠肾皮质，每组200 mg，用BCA试剂盒在酶标仪测定各组蛋白质浓度；经SDS-PAGE凝胶电泳分离，300 mV 1 h转移至PVDF膜上；一抗孵育：加入Id2、E-cadherin、α-SMA或β-actin一抗，工作浓度分别为1∶150、1∶100、1∶100和1∶300，4 ℃孵育过夜；次日，TBST洗膜3×5 min，加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(浓度为1∶5 000、1∶5 000、1∶5 000、1∶8 000)，加ECL荧光显色液，暗室胶片曝光；Quantity one软件分析各条带的面积和灰度值，两者乘积为积分灰度值，每个样本重复操作3次。以β-actin蛋白条带作为内参，结果用目标蛋白/β-actin比值表示，即同一张胶上Id2、E-cadherin、α-SMA与相应的β-actin条带所测积分灰度值的比值，即相对积分灰度值对Id2、E-cadherin、α-SMA蛋白半定量。

1.2.7肾组织Id2 mRNA的表达RT-PCR检测肾组织Id2 mRNA的表达。反应产物做1.5%琼脂糖凝胶电泳，Bio-Rad 凝胶成像系统扫描，应用Quantity one软件将各Id2条带的光密度值与β-actin条带光密度值的比值作为Id2 mRNA相对表达水平参数，进行半定量分析。

表1　PCR引物序列及扩增条件

1.3　统计学方法

2结果

2.1　大鼠一般状况

STZ诱导的糖尿病大鼠模型复制成功后，DM组大鼠逐渐出现多饮、多尿、多食、消瘦等现象。N组无变化，体重明显增加。而DMT组大鼠较同时间未治疗组相比，多饮、多尿、多食现象有所改善，且体重较之增加。

2.2　生化指标及肾脏指数

各时间点DM组与N组相比，血糖、24 h尿蛋白量、肾脏指数均显著升高(P<0.01)，而DMT组上述各指标比相应时点DM组明显降低(P<0.05)。见表2。

表2　各组大鼠的血糖浓度、尿

(1)与N组比较，P<0.01；(2)在相同时间点，与DM组比较，P<0.05

2.3　肾组织形态变化

HE染色见正常组大鼠肾小球形态完整，轮廓清晰，系膜细胞无增生，肾小管未见异常，基底膜完整。糖尿病大鼠可见肾小球系膜基质增生，肾小管管腔扩张，上皮细胞肿胀及空泡变性，基底膜不规则增厚，间质可见炎症细胞浸润。胰岛素治疗组大鼠肾脏病变有所改善，炎症细胞浸润减轻。见图1A-C。PAS染色显示正常大鼠肾小球及肾小管结构清晰，肾小管未见扩张、变性坏死，无PAS阳性染色物质沉积。糖尿病大鼠肾小球系膜区扩张，细胞外基质增多，肾小管上皮细胞变性，甚至可见萎缩和脱落细胞，间质有较多细胞浸润，肾小管间质区PAS染色阳性物质增多。治疗组大鼠肾脏病变有所改善，肾小球和肾小管间质区PAS染色紫红色的阳性物质明显减少。见图1D-F。

2.4　FN蛋白的表达

免疫组织化学染色显示N组大鼠肾小管基底膜内可见FN表达，排列呈线性，肾间质内未见表达。DM组可见肾小管间质FN表达，从2 w开始逐渐增多(P<0.05)，DMT组较DM组FN表达显著减少(P<0.05)。见图2。

2.5　Id2、E-cadherin及α-SMA蛋白的表达

N组大鼠肾小管上皮细胞Id2蛋白表达较多，DM组Id2随病程周数增加逐渐减少(P<0.05)，至24 w几乎不表达，DMT组Id2蛋白的表达显著增加，但仍低于正常对照组； E-cadherin与Id2的变化同步，N组表达较多，DM组大鼠随病程进展E-cadherin进行性下降，DMT组大鼠在胰岛素控制血糖后E-cadherin的表达明显恢复；而α-SMA在N组中表达极少，DM组从16 w开始可见α-SMA蛋白表达明显增多，以后维持在较高水平上，DMT组大鼠在给与胰岛素治疗后，α-SMA表达明显降低(P<0.05)。见图3。

2.6　Id2 mRNA表达

Id2 mRNA的表达同其蛋白表达趋势一致，DM组大鼠肾组织中Id2 mRNA表达均显著低于N组(P<0.05)。DMT组Id2 mRNA表达较同时间点DM组表达增多(P<0.05)，但仍低于N组。见图4。

2.7　相关性分析

将各组大鼠肾小管FN蛋白免疫组化阳性结果以及E-cadherin蛋白的积分灰度值分别与各组肾小管中Id2 蛋白免疫组化阳性表达量进行相关分析，结果显示r值分别为-0.931(P<0.05)和0.900(P<0.05)，说明Id2蛋白与FN蛋白成负相关，与E-cadherin蛋白成正相关。

3讨论

本研究用STZ成功复制了大鼠DM模型。在整个实验期间实验组大鼠血糖持续在高水平。HE和PAS染色显示了DM大鼠出现肾实质损害的表现，24 h尿蛋白量和肾脏指数呈进行性升高，表明发生了DN。

注：图A-C为HE染色图片，图D-F为PAS染色图片图1　16 w时正常对照组、糖尿病组和胰岛素治疗组大鼠肾组织形态(200×)Fig.1　Histological changes of kidney tissues in N，DM and DMT group at 16 w

图2　各组大鼠肾组织FN蛋白表达(SP法，×400)Fig.2　The levels of FN protein expressed in kidney tissues of each group

DN肾损伤早期可出现肾小管的病变，且不依赖肾小球病变直接导致肾功能恶化，其主要分子机制之一为EMT，而肾小管上皮细胞发生EMT的主要标志是上皮表型如E-cadherin、角蛋白丝等逐渐消失，而获得间质表型如α-SMA出现并增多，细胞极性丧失，与周围细胞和基质的接触减少，细胞的迁徙和运动能力增强等。本研究结果显示DM组大鼠肾组织细胞外基质FN较N组表达显著增多，并且伴有肾小管上皮细胞表型标志物E-cadherin的显著减少而间质细胞表型标志物α-SMA的大量表达；控制血糖后，FN表达显著降低，同时α-SMA的表达显著减少，而E-cadherin的表达增加，表明随糖尿病病程的进展，肾小管上皮细胞发生了EMT，引起细胞外基质的沉积，纤维化程度进行性加重，胰岛素控制血糖后肾小管上皮细胞EMT被逆转，肾脏纤维化程度减轻，这与本课题组以往的研究相一致。

越来越多的研究证明，螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix，HLH)家族的一些成员也参与了EMT过程。Id蛋白是一种广泛存在于哺乳动物细胞中的核转录因子的负调控蛋白，属于HLH转录因子家族特别成员，哺乳动物含有四种Id因子(Id1-Id4)，含119~199个氨基酸残基，因Id蛋白本身缺乏DNA结合所必须的碱性结构域，与bHLH结合成异二聚体后，可抑制bHLH与DNA及其他组织特异性bHLH转录因子结合，具有抑制细胞分化、促进细胞增殖作用、诱导细胞凋亡、维持细胞存活，促进血管形成等作用。目前一些研究发现Id蛋白与一些脏器纤维化有关且可能有抑制EMT发生的作用。在鼠乳腺上皮NMuMG细胞系中，Id2被认为是EMT的负调控因子，TGF-β1可通过Smad依赖途径诱导Id2/3转录因子的下调。在肺纤维化中，过表达Id2蛋白可影响肺泡上皮细胞表型改变，对肺纤维化具有抑制作用。Veerasamy M等研究发现了TGF-β1处理人近曲肾小管上皮细胞可致Id2的表达减少，Id2的减少对于TGF-β1诱导α-SMA表达是至关重要的，过表达Id2可阻止TGF-β1诱导的α-SMA，而BMP-7不仅可以上调Id2，与TGF-β1联合共同孵育可以恢复Id2至基础水平，BMP-7的这种作用可能与Smad1/5信号通路有关且单个敲低Smad1或Smad5都不能阻断BMP-7对Id2的诱导作用。然而Id2在DN肾组织的动态变化如何及与肾脏纤维化的确切关系目前还不清楚。因此，我们的研究在I型糖尿病大鼠模型中检测到Id2蛋白表达随糖尿病病程的进展逐渐减少，至DM24 w几乎不表达，而mRNA水平随病程延长逐渐减少，至24 w仍有表达，相关性分析显示Id2蛋白与FN蛋白成负相关，与E-cadherin蛋白成正相关；使用胰岛素控制大鼠血糖后发现大鼠肾组织Id2蛋白较同时间点糖尿病组表达有所增高，但仍低于正常对照组，而mRNA结果与蛋白变化一致，与此同时E-cadherin的表达增加、α-SMA表达减少和FN在间质的沉积减少，提示控制血糖能上调肾小管上皮细胞Id2的表达，进而上调E-cadherin表达而下调α-SMA蛋白，起到抑制肾脏纤维化效应，延缓和减轻了肾小管上皮细胞的EMT及肾间质ECM的沉积，改善DN肾纤维化病变，但是有关在糖尿病肾病时的具体机制仍有待进一步的研究证实。另外我们设想是否可以通过提高Id2的表达来抑制高糖致纤维化的作用，并且通过Id2促进E-cadherin蛋白表达来逆转EMT，从而达到改善糖尿病肾病预后的目的也待进一步研究。

注：(1)与N组比较，P<0.05；(2)在相同时间点，与DM组比较，P<0.05 图3　各组大鼠肾皮质Id2、E-cadherin和α-SMA蛋白表达(Western blot)Fig.3　The levels of protein Id2，E-cadherin, and α-SMA expression in kidney tissues of each group

注：(1)与N组比较，P<0.05；(2)在相同时间点，与DM组比较，P<0.05 图4　Id2 mRNA在各组大鼠肾组织中的表达(RT-PCR)Fig.4　The expression of Id2 mRNA in kidney tissues of each groups showed by RT-PCR

4参考文献

[1]Carew RM, Wang B, Kantharidis P. The role of EMT in renal fibrosis. Cell Tissue Res, 2012(1):103-116.

[2]Bertinat R, Silva P, Mann E, et al.Invivosodium tungstate treatment prevents E-cadherin loss induced by diabetic serum in HK-2 cell line. J Cell Physiol, 2015 Feb 28. doi: 10.1002/jcp.24974.

[3]Patil M, Sharma BK, Satyanarayana A. Id transcriptional regulators in adipogenesis and adipose tissue metabolism.Front Biosci (Landmark Ed), 2014(19):1386-1397.

[4]Greening DW, Gopal SK, Mathias RA, et al. Emerging roles of exosomes during epithelial-mesenchymal transition and cancer progression. Semin Cell Dev Biol, 2015 Feb 23. pii: S1084-9521(15)00035-X.dio:10.1016/j.semcdb.2015.02.008.

[5]王圆圆, 刘丽荣, 李霜, 等. 蛋白酶体抑制剂MG132减轻糖尿病大鼠肾小管间质纤维化. 基础医学与临床, 2014(2):160-167.

[6]Patel D, Morton DJ, Carey J, et al. Inhibitor of differentiation 4 (ID4): from development to cancer. Biochim Biophys Acta, 2015(1):92-103.

[7]Gervasi M, Bianchi-Smiraglia A, Cummings M, et al. JunB contributes to Id2 repression and the epithelial-mesenchymal transition in response to transforming growth factor-β. J Cell Biol, 2012(5):589-603.

[8]Yang J, Velikoff M, Agarwal M, et al. Overexpression of Inhibitor of DNA-Binding 2 Attenuates Pulmonary Fibrosis through Regulation of c-Abl and Twist. Am J Pathol, 2015(4)1001-1011.

[9]Veerasamy M, Phanish M, Dockrell ME. Smad mediated regulation of inhibitor of DNA binding 2 and its role in phenotypic maintenance of human renal proximal tubule epithelial cells. PLoS One, 2013(1):51842.

(2015-03-10收稿，2015-03-28修回)

中文编辑： 刘平； 英文编辑： 刘华

Study on the Relationship of Changes of Id2 Protein Expression in Diabetic

Rat Kidney Tissues with Occurrence and Development of Fibrosis Lesions

WEN Qingying, SU Bo, XIAO Ying, WANG Yuanyuan, LI Shuang, LIU Lirong, SHI Mingjun, GUO Bing

(DepartmentofPathophysiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang55004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the expressions of Id2 in the renal tubules of STZ-induced diabetic rats before and after blood glucose control, and explore their roles and relationship in the development of diabetic nephropathy. Methods: SD rats were randomly divided into control (N), diabetes mellitus (DM) and insulin-treated DM groups (DMT). DM model was constructed by injecting streptozotocin (STZ) via tail vein (55 mg/kg). 48 SD rats were randomly divided into 4 groups: 2 weeks, 8 weeks, 16 weeks and 24 weeks group. Each group included a control subgroup and a diabetic model subgroup. In addition, for 16 weeks group and 24 weeks group, each group still included an insulin-treated subgroup. Since the 13thweek after modeling, rats in DMT group were given insulin individually. The blood glucose was controlled to the level of 4~7 mmol/L, and urine glucose remained negative. The blood glucose, 24 h urine protein were measured by biochemical method, and the kidney index was measured as well. And the renal fibrosis was examined by HE and PAS staining sections. Immunohistochemistry was employed to assay the expression of FN protein in the rat renal tissue. Western blotting was employed to assay the expression of Id2, E-cadherin and α-SMA protein in the rat renal tissue. In addition, the expression of Id2 mRNA was also examined by RT-PCR. Results: (1)Compared with group N, the blood glucose, 24 h urine protein and the kidney index of group DM increased significantly (P<0.01), and renal tissue presented typical morphologic changes at different time points. By comparison, the blood glucose, 24 h urine protein and the kidney index of group DMT were significantly lower than those in group DM (P<0.05). Lesions of renal fibrosis in DMT rats were obviously relieved. (2)The expression levels of Id2 protein and mRNA of group DM decreased significantly than that in N group at different time points (P<0.05), accompanied by the decreased expression of E-cadherin (P<0.05), increased expression of α-SMA (P<0.05), and increased deposition of FN protein. Correlation analysis showed Id2 protein was negatively correlated with FN protein(r=-0.931, P<0.05), but positively correlated with E-cadherin(r=0.900 0, P<0.05). (3)Compared with DM group, the protein and mRNA expression of Id2 and E-cadherin of DMT group increased significantly (P<0.05), while the expression of α-SMA and FN protein decreased. Conclusion: Blood glucose control can up-regulate the expression of Id2 in renal tubular epithelial cells and restore Id2 negative regulation of renal fibrosis, reverse EMT and relieve renal interstitial ECM deposition, and improve DN lesions of renal fibrosis.

[Key words]diabetic nephropathy; fibrosis; inhibitors of differentiation; fibronectin; E-cadherin; α-smooth muscle actin; rats,Sprague-Dawley

[中图分类号]R363

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2015)04-0330-07

*[基金项目]国家自然科学基金(81360116)；贵州省科学技术基金[编号：黔科合J字(2011)2120号]