不同荞麦品种落粒基因的筛选

李 雪， 黄志强， 姜 君， 陈庆富

(贵州师范大学， 贵州 贵阳 550001)



不同荞麦品种落粒基因的筛选

李 雪， 黄志强， 姜 君， 陈庆富*

(贵州师范大学， 贵州 贵阳 550001)

为获得荞麦落粒性相关基因，分别选取甜荞、苦荞和金荞的不同品种不同组织混合样品进行转录组测序，通过数据库比对、功能分析与功能注释获取与落粒性相关的Unigene。设计引物通过RACE方法扩增候选基因，测序后将候选基因全长序列提交到NCBI数据库中，通过blast寻找候选基因的命名，用实时定量荧光PCR测候选基因的表达量。结果表明：得到6个候选基因，其中，根向光性蛋白基因、SOBIR1-like蛋白基因、NPR5-like蛋白基因主要在花器官的发育和形成过程中起调控作用，而SRG1-like蛋白基因、过氧化物酶基因和AGL蛋白基因主要在植物离区的形成和发育过程中起调控作用。NPR5-like蛋白基因在落粒品种与不落粒品种间的表达量差异最大。结论：NPR5-like蛋白基因在荞麦落粒过程中起一定的调控作用。

荞麦； 落粒性； 转录组； 实时定量荧光PCR

荞麦属于蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum)[1]。有甜荞(F.esculentumMoench)和苦荞(F.tataricum(L.)Gaertn)2个栽培种[2]，其营养丰富，含有丰富的维生素和大量的黄酮类化合物[3-4]，能有效控制和治疗多种疾病，增强身体的免疫力及预防癌症，食用药用价值高[5-7]。但在荞麦的栽培过程中，落粒现象非常严重。落粒现象在豆科、禾本科、十字花科以及胡麻科等植物中广泛存在，是植物在长期生存竞争及进化过程中为抵御恶劣外界环境及繁衍后代逐渐形成的一种适应机制[8-9]。落粒对农业生产造成巨大损失，大量种子在收获前自然脱落，不仅增加采收难度，提高生产成本，而且使种子质量和产量均受到严重影响。因此，通过减少落粒现象提高荞麦的产量和质量对于荞麦生产和栽培具有重大意义。

近年来，研究者对不同植物的落粒现象进行了大量研究，早期主要侧重于生理生化方面，通过长期的驯化实践不断地对作物器官脱落特性加以选择，解决禾本科作物落粒、断穗，豆类作物提前开荚等问题，减少了产量损失。随着分子生物学的发展，解析离区发育和落粒现象的分子机制逐渐成为研究热点[10]。研究发现，植物激素尤其是乙烯、ABA以及生长素之间的相互作用在植物落粒性中起着重要作用[11-14]。此外，在拟南芥中发现了1对控制花器官离区发育的功能重复基因BOP1和BOP2[15]，以及MADS-box基因AGL15和AGL18，其过表达可以延迟花器官的脱落[16-17]。Li等[18]通过QTL定位法研究水稻的落粒性时发现，SH4基因可控制离区的发育。但荞麦的落粒性相关基因筛选前人尚未有研究，为进行荞麦落粒相关基因筛选，在无参考基因组的情况下，笔者对不同荞麦品种进行转录组测序，通过数据库比对以及功能基因的分析获得荞麦落粒性相关的候选基因，然后利用实时定量荧光PCR获得候选基因在不同荞麦品种上的相对表达量差异，旨在探索荞麦不同品种中与落粒性相关的基因，为降低荞麦落粒性和提高其产量、品质提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 转录组测序材料

由于落粒性与叶柄处的离区相关，故取叶组织和灌浆期的花序组织作为测序样本。于2013年5月在贵阳市永乐乡贵州师范大学柏杨实验基地分别取甜荞、苦荞和金荞不同品种的叶组织和花序组织，置于EP管中，-80℃冰箱保存(表1)。

1.2 实时定量荧光PCR的材料

由于自然界中的金荞均为落粒品种，而甜荞和苦荞均有落粒品种和不落粒品种，故于2014年10月在贵阳市永乐乡贵州师范大学柏杨实验基地分别取甜荞、苦荞和金荞不同品种的花序，置于EP管中，-80℃冰箱保存(表2)。以金荞作为落粒性品种的对照，与甜荞和苦荞的不同品种进行实时定量荧光PCR。

表2 用于实时定量荧光PCR的材料情况

1.3 转录组测序与Unigene的筛选

提取用于转录组测序的样本总RNA，用OligoT探针引物分离带有PolyA的mRNA，纯化后反转录成cDNA。构建不同大小片段的cDNA文库，进行基因组测序。把获取的各样品Reads采用Trinity软件[19]进行组装，获得序列重叠群，将重叠群组成转录本，再将各样品组装结果中多个可变剪接的转录本聚类到1个基因，最后得到对应物种的1个Unigene库。利用筛选得到的Unigene序列信息，预测得到对应Unigene的编码序列和蛋白序列。使用IDE6 software对差异基因进行检测，并对检验结果进行FDR校正，得到差异基因。对筛选出的差异表达的基因作表达模式聚类分析，将具有相同或相似表达行为的基因聚类。通过Unigene核酸序列与数据库的blast比对，提取得到差异表达基因Nr，Nt，GO，COG，kegg，swissprot，trembl等库的注释，根据注释结果选出与荞麦落粒相关的Unigene。

1.4 RACE方法扩增基因全长序列

改良Trizol法[20]提取各荞麦样品总RNA，紫外分光光度计检测其浓度和纯度，-80℃保存。以各荞麦样品总RNA为模板，使用M-MLV Reverse Transcriptase(Takara, Japan)反转录成cDNA，简并引物，通过降落式PCR反应克隆得到各候选基因保守区片段。分别设计上游外侧和内侧特异性引物GSP1和GSP2以及下游外侧和内侧特异性引物GSP1和GGSP2(表3)，利用3′-RACE外侧引物(5′-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3′)、3′-RACE内侧引物(5′-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3′)、5′-RACE外侧引物(5′-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA-3′)和5′-RACE内侧引物(5′-CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG-3′)，通过3′-FullRACE Core Set with PrimeScript RTase试剂盒和5′-Full RACE Kit with TAP试剂盒进行3′-RAEC和5′-RACE扩增。将保守区片段、3′-RAEC和5′-RACE片段拼接后获得各候选基因的全长cDNA序列，设计特异引物(表4)进行扩增。将PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，利用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(Axygen，USA)切胶回收，纯化后连接到pMD18-T-simple载体(Takara,Japan)，转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆后，测序鉴定。

表3 候选基因上游和下游的内外侧特异性引物序列

Table 3 The sequence of inside and outside specific primers of upstream and downstream regions of candidate genes

候选基因编号No.ofcandidategenes引物序列5'—3'Primerssequences1上游 GSP1CACACGGACTTCGCACAACC GSP2AAGAAGTTTACACTATTGGGTCCTG下游 GSP1GTGTAAACTTCTTGGGGAGCTTC GSP2GAATGTCATTAGAGCTTGGGTTG2上游 GSP1AATTACATCTGAAGCTTCTCGGG GSP2CCTGCCCACTCTAGCTTTCTG下游 GSP1TGTATCTTAGCATTTCCAGAAGGAG GSP2TGTATGTGAGCGCAGGTGAAG3上游 GSP1CCAAGACATTAGGAAAGCTGAATC GSP2GATCAGGCGGTGGTTCAAAG下游 GSP1AACGCTGTCCAGGTCGAAGAG GSP2TCTCCTTCTCCACGAATCCTG4上游 GSP1AAGTGTTATGAGTGGAAGAAGATTGC GSP2TCTACTTGAGTATTGGTATCCCGG下游 GSP1GCCTGATCGACAAACCAACG GSP2TTCTGCGGTTCTCATCGTCC5上游 GSP1AATTCTGCATGTGCTTCCTGG GSP2TCTTTAGGGTGATGCTGACAGG下游 GSP1TACGCCACAATCTTATCCATCG GSP2AAACGGATATGTCGATGTCAGC6上游 GSP1GGGTATACTTTTGTATTGGCGGA GSP2GGGGTTTATGTATTTATCGTGTCC下游 GSP1GAGGAGGTCATGGAAGAACGAG GSP2GGATCGGAGGCTGAGGAGAC

表4 候选基因的扩增特异引物

Table 4 Specific primers for amplification of candidate genes

候选基因编号No.ofcandidategenes引物序列5'-3'Primerssequences1上游 ATGTATTGTTAAGTCCTACCAAGCG下游 CTTCCATGGGAGGTGAGGATG2上游 AAGAGGCCGTGATTGTGTGAG下游 CGAATGAGTTTAAAGGCGTTG3上游 CGGATCCAAATGTAAGAACCG下游 GGGCGAGGTTCATGTTTCTG4上游 CACTCCACTTGGCAGCCG下游 ATCGAGAGCGAGATCAACGG5上游 AAAGATATGGGAGTATTGGTGGG下游 GCCTCTCCCCCTTACATCTCC6上游 GAGTTGAACTTGTTACAGACCGTC下游 GGAGTCTTTTGTTGACGGTCTG

1.5 生物信息学分析

将得到的各候选基因cDNA全长序列利用NCBI的BLAST在线软件(http://blast.ncbi.nm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)进行比对，通过分析其覆盖度和功能得到各候选基因的命名和相应的基因功能。

1.6 实时定量荧光PCR

设计实时定量荧光PCR检测目的基因引物(表5)，由北京Invitrogen公司合成。利用改良Trizol法[18]提取各样本RNA，紫外分光光度计检测其浓度和纯度，-80℃保存。采用PrimeScritTMRT reagent Kit with gDNA Eraser进行cDNA反转录，获得各样品cDNA，-20℃备用。以5.8SRNA为内参基因，利用ABI7500型实时定量荧光PCR仪进行各样本的实时定量荧光PCR试验：首先用SYBRPremix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)，ROX plus进行扩增，扩增程序为95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火40 s，45个循环；然后将各样本cDNA混合后为模板进行5倍梯度的稀释，取稀释后各样品用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60～95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则筛选引物；最后将各样品cDNA进行10倍稀释后作为模板，分别用目的基因引物和内参基因引物扩增，同时在60～95℃进行溶解曲线分析。得到各样本试验结果后，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。

表5 实时定量荧光PCR检测目的基因引物

2 结果与分析

2.1 转录组测序得到候选Unigene

将样品进行转录组测序，共得到14.5 Gb的可用数据，通过数据库比对与功能注释的方法筛选得到6条与落粒相关的Unigene，功能分析与功能注释表明，这些Unigene分别具有不同的功能(表6)，可能通过参与荞麦不同的生理过程，调控荞麦的落粒性。

2.2 RACE扩增候选基因及其生物信息学分析

从表7看出，这些基因均直接或间接地参与花器官以及离区的发育。其中，根向光性蛋白基因、SOBIR1-like蛋白基因和NPR5-like蛋白基因主要在花器官的发育和形成过程中起调控作用，而SRG1-like蛋白基因、过氧化物酶基因和AGL蛋白基因主要在植物离区的形成和发育过程中起调控作用。

表6 转录组结果中Unigene参与的生理功能

Table 6 Physiological function of Unigenes in transcriptome

Unigene序号Unigenenumber功能Unigenefunction1参与花器官的切除及花形态的发生2参与离层形成过程与器官衰老3参与顶端分生组织的发育与花粉成熟4参与分生组织的形成过程及花器官的切除5参与离层细胞壁的修饰6参与离层及细胞壁的形成

表7 候选基因的命名与功能

图示 各基因实时定量荧光PCR相对定量

Fig. Relative quantitative result of different genes by RT-quantitative PCR

2.3 实时定量荧光PCR与候选基因的表达量

从图示看出，6个基因在5个品种中的相对表达量不同，其中，根向光性蛋白和AGL蛋白2个基因在红心金荞、野甜荞和野苦荞3个落粒品种中的相对表达量较高，而SRG1-like蛋白和NPR5-like蛋白2个基因在晋荞2号和甜自21号2个不落粒品种中的相对表达量较高，而NPR5-like蛋白基因在落粒品种与不落粒品种间的表达量差异最大。

3 结论与讨论

研究选取不同荞麦品种的不同组织作为转录组测序材料，在无荞麦参考基因组的情况下，通过高通量测序分析与功能注释获得6个与荞麦落粒性相关的Unigene。由于目前无荞麦全基因组的测序工作，因此，无法直接通过转录组测序与比对直接获得需要的基因，故通过转录组测序后在相关数据库中进行比对，进行功能分析与功能注释，从中筛选出与目的功能相关的Unigene是常用方法。然后设计RACE特异引物，通过RACE扩增的方法得到6个候选基因的全长序列，并将得到的全长序列提交到NCBI的blast进行比对，通过结构与功能分析确定6个候选基因的命名。经分析，这6个基因均参与植物重要的生物学过程，且直接或间接地参与花器官的发育或者离层的形成。然后通过实时定量荧光PCR得到6个基因在不同荞麦品种中的相对表达量差异。结果表明，6个基因中在落粒品种与不落粒品种间表达量差异最大的为NPR5-like蛋白基因，且其在甜自21号和晋荞2号2个不落粒品种中的表达量比在金荞、野甜荞和野苦荞3个落粒品种中的表达量高。说明，NPR5-like蛋白基因在荞麦落粒过程中起一定的调控作用。

已有研究表明，植物的落粒性与花器官的发育和离层细胞的形成和发育有关[21-22]。而本试验中通过荧光定量结果分析得到的NPR5-like蛋白基因与前人研究一致。NPR5被称作BOP2，编码细胞质和核定位NPR1-like蛋白BOP2，能与BOP1互作。NPR6又被称作BOP1，是蜜腺发育和正常离层区形成必需的蛋白。bop1/bop2双突变体的叶子更持久，经常有小叶在叶柄上。BOP2和BOP1主要参与平衡植物的生长发育，与植物的落粒性有密切的关系[23]。因此，NPR5-like蛋白基因可能是通过与其蛋白家族其他相关基因相互作用，参与荞麦的不同生理过程，从而影响花器官的发育和离层细胞的形成而参与荞麦的落粒过程，调控着荞麦不同品种的落粒性，但对于NPR5-like蛋白在荞麦落粒过程中的详细作用机制还有待进一步研究。

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(责任编辑： 刘忠丽)

Screening of Seed-holding Gene in Different Buckwheat Varieties

LI Xue, HUANG Zhiqiang, JIAN Jun, CHEN Qingfu*

(GuizhouNormalUniversity,Guiyang,Guizhou550001,China)

Six candidate genes related to seed-holding character of buckwheat were determined from different tissue ofF.esculentum,F.tataricumandF.dibotrysby RT-PCR to obtain genes related to seed-holding character of buckwheat. The results showed that root phototropism protein gene, SOBIR1-like protein gene, and NPR5-like gene have the regulating effect onthe floral organ development and formation process, but SRG1-like protein gene, peroxidase gene and AGL protein gene have the regulating effect onthe development and formation process of abscission zone in buckwheat mainly. There is significant difference in expression quantity of NPR5-like gene between shattering buckwheat variety and non-shattering buckwheat variety, which indicates that NPR5-like protein gene has a certain regulating effect onseed shattering process in buckwheat.

buckwheat; seed-holding; transcriptome; real-time quantitative PCR

2014-03-14； 2015-05-04修回

国家燕麦荞麦现代农业产业技术体系专项“荞麦育种岗位专项资金”(CARS-08-A4)；国家自然科学基金项目“荞麦属植物落粒性相关基因研究”(31060207)，“荞麦落粒性的遗传规律及其基因序列研究”( 31171609)；贵州百十千人才计划

李 雪(1987-)，女，在读硕士，研究方向:从事植物遗传、进化与育种。E-mail:492733153@qq.com

*通讯作者：陈庆富(1966-)，男，教授，博士，从事植物遗传、进化与育种工作。E-mail:cqf1966@163.com

1001-3601(2015)05-0227-0019-05

S517

A