镉胁迫对4种草坪草抗逆生理特性的影响

陈 伟，张苗苗，宋阳阳，张德罡

（1.甘肃农业大学 草业学院／草业生态系统教育部重点实验室／甘肃省草业工程实验室／中－美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070；2.兰州城市学院，甘肃 兰州 730070；3.甘肃农业大学 林学院，甘肃 兰州 730070）

随着工业化进程的不断加快，环境污染成为日益突出的生态问题之一。重金属在土壤中的不断积累与富集也对环境造成严重危害。Cd是毒性很强的一种重金属，也是农田受污染最普遍的重金属之一，被联合国环境规划局和国际劳动卫生重金属委员会认定为重点环境污染物，被美国毒物管理委员会列为第6位危害人体健康的有毒物质［1］。Cd在自然界中主要来自岩石和矿物中的本底值，岩石圈中Cd的含量在0.1～0.2 mg／kg［2］，不会对人体及生态系统构成危害。但是随着采矿、冶炼和电镀工业的不断发展，大量含Cd废水排入河流。同时，某些磷肥含有大量的Cd，在使用过程中会造成Cd在土壤中的累积。另外，由于Cd在生物体内迁移性比较强，在人体中累积达到一定程度，会造成慢性中毒［3－5］。

重金属对植物产生胁迫后，植物会发生一系列生理生化反应来抵御这种逆境。以4种草坪草种为对象，通过盆栽试验研究了Cd2＋对草坪草脯氨酸含量、MDA含量和抗氧化酶活性等抗逆生理特性的影响，探讨草坪草对Ca2＋耐受能力，为研究草坪草抗重金属胁迫机制和筛选抗性草种提供数据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试草种：草地早熟禾 （Poa pratensis）品种百斯特（Barrister），多年生黑麦草（Lolium perenne）品种首相（Premier），高羊茅（Festuca elata）品种锐步（Barrera），白三叶（Trifolium repens）品种海发（Haifa），由百绿公司提供。供试金属离子：3CdSO4·8H2O分析纯试剂。

1.2 重金属离子处理梯度设置

重金属离子以溶液形式加入到培养皿中，重金属离子浓度依据中华人民共和国国家土壤环境质量标准（GB15618－2008）3级土壤环境标准量进行配制［6］，结合预试验结果设置Cd2＋浓度，其浓度梯度依次为Cd2＋（1，50，100，150 mg／kg）。同时设置对照处理。

1.3 试验方法

将供试种子弃去杂质和有虫蚀及成熟度较低的种子，用0.1%KMn O4溶液浸泡15 min，用自来水冲洗数次，至无红色为止，再用去离子水冲洗3次，用滤纸将水吸干。直接播入以蛭石为基床、直径12 cm花盆，发芽方法按GB／T 2930.4－2001，待草坪草幼苗长出2片展开叶时按照1株／cm2的标准剔除多余幼苗，根据培养基70%持水量每天注入Hoagland’s营养液并将重金属无机盐溶液按梯度施入，当幼苗长出第4片叶时进行生长发育指标的测定。

1.4 草坪草抗逆生理指标测定

1.4.1 脯氨酸含量测定 采用酸性茚三酮法［7］。

单位鲜重样品中脯氨酸含量＝（x×5／2）／（样重×106）×100%

MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法，称取各供试草坪草叶片材料1 g，加入2 m L 10%的三氯乙酸（TCA），研磨，最后用TCA定容10 m L。

MDA（μmol／L）＝6.45×D532nm－0.56×D450nm

酶的提取：取0.1 g叶片与预冷研钵中，加入1 mL酶提取液以50 mmol／L pH 7.8的磷酸缓冲液配制，含有0.1 mmol／L EDTA、质量浓度为0.3%Triton X－100和质量浓度为4%聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP），在冰浴上研磨成匀浆，加酶提取液使终体积为5 mL。在冷冻离心机中4℃下，10 000 r／min，离心20 min，取上清液用于酶活力测定。

SOD活性的测定采用氮蓝四唑（NBT）法测定，POD活性的测定采用愈创木酚法测定。

1.5 数据统计分析

运用Excel整理数据、制作相关图表，用SPSS统计软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 Cd2＋胁迫对草坪草脯氨酸含量的影响

Cd2＋胁迫下4种草坪草脯氨酸含量均显著高于对照（图1），且随离子浓度的升高而升高。其中，高羊茅和草地早熟禾脯氨酸含量在不同浓度Cd2＋胁迫下差异显著（P＜0.05）；多年生黑麦草在Cd2＋浓度为0～100 mg／kg处理时脯氨酸含量差异显著（P＜0.05），但是在Cd2＋浓度为100 mg／kg和150 mg／kg处理下脯氨酸含量差异不显著。Cd2＋浓度为0，1和50 mg／kg时，白三叶脯氨酸含量差异显著，但是，随着离子浓度的升高，白三叶脯氨酸含量差异不显著（P＜0.05）。

图1 Cd2＋胁迫下草坪草脯氨酸含量Fig.1 Effect of Cd2＋ on proline content of turfgrass

2.2 Cd2＋胁迫对草坪草MDA含量的影响

Cd2＋各浓度处理下，4种草坪草 MDA含量随着离子浓度的升高而不断增加（图2），均与对照差异显著（图2）。其中，高羊茅和草地早熟禾 MDA含量在Cd2＋各浓度处理之间差异显著（P＜0.05）；多年生黑麦草在Cd2＋浓度为1 mg／kg，50 mg／kg时其 MDA含量差异不显著，在100，150 mg／kg时其 MDA含量差异显著；白三叶 MDA含量在Cd2＋浓度为0，1，50，100 mg／kg时差异显著，但是100和150 mg／kg处理下其MDA含量差异不显著（P＜0.05）。

图2 Cd2＋胁迫下草坪草MDA含量Fig.2 Effect of Cd2＋ on MDA content of turfgrass

2.3 Cd2＋胁迫对草坪草抗氧化酶活性的影响

随Cd2＋浓度增加，草地早熟禾SOD活性均与对照差异显著（P＜0.05），且有随着离子浓度的升高有逐渐升高的趋势；Cd2＋处理多年生黑麦草、高羊茅和白三叶，低浓度时其SOD活性变化不大，与对照差异不显著，但随着Cd2＋离子浓度的升高，SOD活性上升，在Cd2＋浓度为150 mg／kg时，供试草坪草SOD活性达到最大值（表1）。

表1 Cd2＋胁迫下草坪草SOD的活性Table 1 Effect of Cd2＋on SOD activity of 4 turfgrasses

Cd2＋胁迫对草坪草POD活性会产生不同程度的影响（表2）。其中，Cd2＋处理下高羊茅和草地早熟禾POD活性急剧上升，在低浓度处理下显著高于对照，而且随着离子浓度的升高而逐渐升高；Cd2＋浓度为1 mg／kg时，多年生黑麦草和白三叶POD活性与对照差异不显著，稍有升高，当Cd2＋达到50 mg／kg及更高时，2种草坪草POD活性急剧升高，显著高于对照，且随着离子浓度的升高而不断升高。

表2 Cd2＋胁迫下草坪草POD活性Table 2 Effect of Cd2＋on POD activity of 4 turfgrasses

3 讨论与结论

脯氨酸是植物蛋白的组成之一，一方面作为细胞内重要的渗透调节物质，起着调节细胞渗透平衡、增强细胞结构稳定性和组织氧自由基产生的重要作用［8］；另一方面由于脯氨酸具有偶极性，其疏水端与蛋白质联结，而亲水端与水分子相结合，从而使蛋白质束缚更多的水，防止在渗透胁迫条件下蛋白质脱水，增强了细胞膜结构的稳定性［9，10］。研究表明，在逆境条件下，植物为了防御伤害，维持正常的生理生化功能，体内必然相应地产生一系列物质代谢变化，游离脯氨酸含量的大量积累就是这些变化之一［8，11］。从试验结果可以看出，不同浓度Cd2＋处理对4种草坪草都产生了一定程度的胁迫。其中，高羊茅和草地早熟禾脯氨酸含量在不同浓度Cd2＋胁迫下差异显著，多年生黑麦草在Cd2＋浓度为0，50，100 mg／kg处理时脯氨酸含量差异显著，但是在Cd2＋浓度为100和150 mg／kg处理下脯氨酸含量差异不显著，说明Cd2＋胁迫对多年生黑麦草有一定影响，但是当Cd2＋浓度达到较高水平时多年生黑麦草脯氨酸含量差异不显著；白三叶在Cd2＋浓度为0，1，50 mg／kg脯氨酸含量差异显著，在50，100，150 mg／kg处理差异不显著，可能是白三叶对Cd2＋较高浓度胁迫反应不敏感，对Cd2＋有较强耐受性，也可能情况刚好相反，Cd2＋较低浓度处理就已经达到白三叶能够耐受的最大范围，从而导致不能正常分泌脯氨酸。

细胞膜是植物细胞的保护组织，各种逆境胁迫对细胞的危害首先作用于细胞膜［12］。重金属是细胞脂质过氧化的诱导剂，当重金属处理植物时，细胞内自由基产生和消除之间的平衡受到破坏，导致大量活性氧自由基产生，进而引发膜中不饱和脂肪酸产生过氧化反应，破坏细胞膜结构和功能［13，14］。不饱和脂肪酸所发生的一系列活性氧反应的产物丙二醛（MDA）成为反应细胞膜损伤程度的重要指标［8，15］。在重金属离子胁迫下，细胞膜受到伤害，胞内离子和有机物大量外渗，外界有毒物质进入细胞，最终导致植物体内一系列生理生化过程失调［13］。大量研究证明，重金属离子浓度越高，丙二醛累积越多［16－20］。

结果表明，Cd2＋对4种草坪草细胞膜影响较大，草坪草MDA含量随着离子浓度的升高而不断增加，且与对照差异显著；其中，高羊茅和草地早熟禾MDA含量在Cd2＋各浓度处理之间差异显著；多年生黑麦草在Cd2＋浓度为1，50 mg／kg时其MDA含量差异不显著，在50，100和150 mg／kg时其 MDA含量差异显著，说明多年生黑麦草细胞膜对一定浓度的Cd2＋胁迫有相应的耐受性，但是随着离子浓度的升高，对细胞膜的胁迫影响越大；白三叶MDA含量在Cd2＋浓度为0，1，50，100 mg／kg时差异显著，但100和150 mg／kg处理下其MDA含量差异不显著，这是在这一浓度处理下，对白三叶细胞膜的影响已经超出了植物所能耐受的最大范围，细胞正常生理代谢受到影响，植物已丧失了基本的代谢功能，也可能是草坪草细胞逐渐适应了高浓度重金属离子处理，诱导了植物体内抗氧化系统酶类活性增加或抗氧化物质积累，从而促进了植物清除超氧离子自由基的能力，从而在重金属离子高浓度处理下其MDA含量不再继续升高。

SOD是一种重要的活性氧防御酶，在消除超氧物自由基、减轻脂质过氧化作用和膜伤害方面起着重要作用［21］。POD是植物体内清除活性氧伤害的酶保护系统，清除超氧自由基，控制膜脂的过氧化作用，保护细胞膜的正常代谢［22］。SOD和POD酶活性的变化与植物体内氧化胁迫有关系［23，24］。

Cd2＋对草地早熟禾抗氧化酶活性影响均较大；Cd2＋处理对多年生黑麦草、高羊茅和白三叶抗氧化酶系统表现出低浓度影响较小，高浓度影响较大的趋势，出现这种情况的原因可能是Cd2＋在低浓度时产生轻微刺激作用，在低浓度时对草坪草的正常生理代谢功能影响不大，但是当浓度达到一定程度后，反而会对植物机体造成一定程度的伤害，从而造成抗氧化酶活性的升高来对抗胁迫反应。

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