帽儿山异色瓢虫野外越冬前体内CAT和SOD活性的变化

丁晓霞， 王世新， 姜 礅， 刘琦玮, 孟昭军

(东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040)



帽儿山异色瓢虫野外越冬前体内CAT和SOD活性的变化

丁晓霞， 王世新， 姜 礅， 刘琦玮, 孟昭军*

(东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040)

[目的]了解自然条件下野外越冬前期异色瓢虫[Harmoniaaxyridis(Pallas)]体内超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性的变化情况。[方法]定期采集野外越冬前期的异色瓢虫，并通过紫外分光光度法测定其CAT和SOD活性。[结果]CAT和SOD活性变化与温度、相对湿度和昼长变化均无显著相关性；但2种酶活在11月2日之前均呈上升趋势，而后至12月7日呈上升或下降波动；CAT活性在11月16日达到最高峰，12月7日到达低谷；而SOD活性在11月2日和12月7日达到高峰，11月16日达到低谷，两者变化呈互补性。[结论]当温度低于4.8 ℃、昼长短于10.10 h时，异色瓢虫开始滞育；而温度达-9.0 ℃、昼长短于8.70 h时，绝大多数异色瓢虫滞育越冬；在上述2个滞育点期间，异色瓢虫体内CAT和SOD活性变化明显，其活性大小可作为异色瓢虫滞育越冬的标志。

异色瓢虫；越冬；自然种群；CAT；SOD

异色瓢虫属鞘翅目瓢虫科,是农林害虫的一种重要捕食性天敌, 对各类蚜虫、某些蚧壳虫、粉虱、木虱、螨类以及某些鳞翅目、鞘翅目害虫的卵和低龄幼虫具有控制作用,特别是对蚜虫的控制效果较好[1-2]，作为一种重要的生防天敌, 在全世界农业生产中广泛应用[3]。 目前对异色瓢虫实验种群的研究较多，但关于其自然种群在野外自然越冬的研究较少。在我国东北10、11月份有大量异色瓢虫迁飞到向阳山坡石缝下以及建筑物的向阳墙缝、窗户缝及室内越冬，但在东北的连续低温下，个体死亡率很高[4]。因此，研究自然状态下异色瓢虫越冬情况对保护异色瓢虫自然种群、发挥其自然控害作用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1供试昆虫。2013年10月7日至2014年5月11日，于东北林业大学帽儿山试验林场老爷岭废弃的木屋内每14 d采集一次野外越冬异色瓢虫。将采集的瓢虫放在温度为(25.0±1.5)℃、光周期为16∶8 h的光照培养箱中24 h后，选择活动自如的个体放在-42 ℃低温冰箱保存供酶活测定。

1.1.2供试药剂。0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH7.0,含1.00% PVP、0.04%苯基硫脲和10.00 mmol/L EDTA)；130.00 mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液；750 μmol/L NBT溶液；100 μmol/L EDTA溶液；20 μmol/L核黄素溶液。

1.2 方法

1.2.1CAT活性测定[11]。

1.2.1.1CAT酶液制备。将供试昆虫用预冷的含1.00% PVP、0.04%苯基硫脲、10 mmol/L EDTA的50 mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)在冰浴中用玻璃匀浆器研磨均匀，匀浆液于4 ℃、4 000 r/min离心15 min，取上清液用于酶活测定。

1.2.1.2CAT活性测定。取30% H2O20.5～0.6 ml，加水至50.0 ml，从中取出4.0 ml，加入0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)26.0 ml，测定240 nm波长处OD值，如其OD值在0.50～0.55，即作为CAT的底物溶液。取已预温至25 ℃的底物溶液3.0 ml，在25 ℃下加入粗酶液20 μl，立即测定240 nm波长处的OD值，1 min后再测一次。

1.2.2SOD活性测定[12]。

1.2.2.1SOD酶液制备。同CAT酶液制备方法。

1.2.2.2SOD活性测定。按表1加入试剂。将3只试管于4 000 lx光照下反应20 min(试管1遮光处理)后，全部置于暗处结束反应。以不照光的对照管作空白，分别测定其他各管560 nm波长处的吸光度。

表1 SOD活性测定加样 ml

1.2.3光周期昼长的计算及室内温、湿度的测量。于百度网上查询哈尔滨尚志、阿城及延寿3个地区(样品采集地位于3个地区中间)在采样日期的日出、日落时间，分别计算出其昼长，然后取三地昼长平均值作为采虫地点的昼长数据。

在东北林业大学帽儿山试验林场老爷岭废弃的木屋(采样地点)内安装温、湿度监测仪，温、湿度探头悬在空中，距地面约1 m，温湿度数据记录频率为1次/h，数据连续记录到翌年5月中旬。计算采样日期前3 d每天的温、湿度数据平均值，将其分别作为采样日期温、湿度的3个重复数据，再计算其均值作为采样当天的日平均温度与日平均相对湿度的数据。

1.2.4野外异色瓢虫越冬前期未滞育情况调查。2013年10月7日至2014年5月11日，将每次采集的瓢虫随机分为3份作为3个重复，放在温度(25.0±1.5)℃、光暗周期为16∶8 h的光照培养箱24 h后，分别记录活动自如瓢虫的个体数及“死亡”(大多数滞育)的数量，然后统计每次采集瓢虫的未滞育率。

1.2.5数据处理。通过Excel表格统计酶活数据并做图，利用SPSS17.0对前6次酶活数据与温、湿度和昼长的数据统计结果进行相关性分析。CAT活性：KCAT=(2.303/60)×lg(OD1/OD2)×100，式中OD1为0 min时OD240值；OD2为1 min时OD240值。SOD活性：SOD[U/g(FW)]=(ACK-AE)×VT/(ACK×0.5×W×VS)，式中ACK表示2号对照管的吸光度；AE表示3号试验管的吸光度；VT表示样品液总体积(ml)；W表示样品重量(g)；VS表示测定时样品用量(ml)。

2 结果与分析

2.1 野外异色瓢虫越冬前期未滞育调查由表2可知，在2013年11月2日之前，野外越冬异色瓢虫均未进入滞育；在11月2～16日期间超过50%的越冬瓢虫进入滞育；12月21日越冬瓢虫绝大多数进入滞育。也就是在温度低于4.8 ℃、昼长时间短于10.10 h时，异色瓢虫开始进入滞育；在温度接近1.0 ℃、昼长时间达9.50 h时，超过50%的野外异色瓢虫进入滞育越冬；在温度达到-9.0 ℃、昼长短于8.70 h时，绝大多数异色瓢虫进入滞育越冬。2014年5月11日打破滞育的瓢虫数量未作统计。

表2 异色瓢虫越冬前期未滞育调查

2.2 异色瓢虫体内CAT活性的变化与温湿度、昼长的关系由图1可知，自2013年10月7日至11月16日，日平均温度逐渐下降，在该过程中CAT活性随温度的下降而逐渐上升至越冬前的最高点(0.401 8)；在11月16～30日期间酶活相对稳定；11月30日到12月7日，随着温度降低到冰点以下，CAT活性在12月7日大幅度下降达到越冬前的最低点(0.057 1)；但经统计分析，CAT活性变化与温度变化无相关性(r=0.246,P=0.639)。到2014年5月11日，随着春天温度的升高，CAT活性也逐渐增大。

相对湿度自2013年10月7日先下降，在10月19日有所上升，从11月2日开始逐渐下降至12月7日，至次年5月11日又有所升高(图2)。在11月16日之前，CAT活性逐渐升高，在11月30日，CAT活性变化很小而相对湿度剧烈下降，CAT活性变化与相对湿度无相关性(r=0.218,P=0.679)，至2014年5月11日CAT活性随相对湿度升高而升高。

由图3可知，昼长随日期呈线性变化，而CAT活性则是从2013年10月7日开始升高至11月30日达到近似稳定，在11月30日至12月7日CAT活性急剧下降，CAT活性变化与昼长无相关性(r=-0.101,P=0.849)。至2014年5月11日昼长显著增加的同时CAT活性也有所上升。

2.3 异色瓢虫体内SOD活性的变化与温湿度、昼长的关系由图4可知，SOD活性先随日平均温度的迅速降低而大幅度升高，至11月2日酶活达最高值[256.1 U/g(FW)]；随温度继续降低，至11月16日酶活到达最低值[52.4 U/g(FW)]，后随温度的下降SOD活性至12月7日又升到一个高度[128.3 U/g(FW)]；SOD活性变化与温度呈低度相关(r=0.346,P=0.499)。至2014年5月11日随温度升高，SOD活性反而降低。

由图5可知，2013年10月7日至11月2日相对湿度先下降后上升，而SOD活性则一直上升；11月2日至12月7日相对湿度持续下降，而SOD活性则先下降后上升；SOD活性变化与相对湿度无相关性(r=-0.042,P=0.937)。至2014年5月11日，相对湿度上升而SOD活性下降。

由图6可知，2013年10月7日至12月7日，SOD活性在昼长持续缩短的情况下先上升后下降再上升；SOD活性变化与昼长呈低度相关(r=0.318,P=0.538)。2014年5月11日随昼长增加而SOD活性下降。

2.4 CAT与SOD活性变化的关系由图7可知，在2013年10月7日至11月2日越冬刚开始时，CAT和SOD活性都逐渐升高；而2013年11月2日至2014年5月11日期间，CAT和SOD活性呈相对互补性的升降变化，但统计表明CAT与SOD活性变化无相关性(r=-0.197,P=0.708)。

3 讨论

试验结果表明，CAT和SOD活性变化与温度、相对湿度和昼长变化均无明显相关性。但2种酶活在11月2日瓢虫越冬前期均呈现上升趋势，而后至12月7日呈上升或下降波动；CAT活性在11月16日半数瓢虫进入越冬期达到最高峰，12月7日瓢虫越冬期到达低谷；而SOD活性在11月2日瓢虫越冬前期及12月7日瓢虫越冬期达到高峰，11月16日半数瓢虫进入越冬期达到低谷，两者变化具有互补性。有研究表明，温度对异色瓢虫的存活影响最大, 湿度次之, 温湿度的交互作用不明显[4]。该研究也表明，温度(11月16日温度接近冰点，而11月30日和12月7日温度在冰点以下)对越冬前期异色瓢虫体内CAT和SOD活性的影响较明显。

对于不同种昆虫，其保护酶活力变化的趋势有所不同[10]，甚至同种昆虫不同个体生命力的不同体现在酶活性上也存在差异[14]。同时，野外温、湿度等条件的变化不像室内呈规律性，也是造成该试验结果酶活性变化与几种因子未达到显著相关的原因。

[1] 王小艺，沈佐锐.异色瓢虫的应用研究概况[J].昆虫知识,2002, 39(4)：255-261.

[2] 李艳, 邵阳光, 孙辉.异色瓢虫——简单而方便的遗传学实验材料[J].生物学通报, 2001, 36(3)：12-15.

[3] 王甦，张润志，张帆. 异色瓢虫生物生态学研究进展[J]. 应用生态学报，2007，18(9)：2117-2126.

[4] 马春森,何余容,张国红,等.温湿度对越冬异色瓢虫(Harmoniaaxyridis)存活的影响[J].生态学报,1997,17(1)：23-28.

[5] 薛方森,魏洪义,朱杏芬.黑纹粉蝶滞育蛹体内过氧化氢酶活力的研究[J].植物保护学报,1997,24(3)：204-208.

[6] 吴小锋,徐俊良,崔为正.家蚕血淋巴超氧化物歧化酶活力及其影响因素[J].蚕业科学,1997,23(1)：38-41.

[7] 吴小锋,徐俊良,崔为正,等.家蚕血淋巴中过氧化物酶活力及其影响因素[J].蚕业科学,1998,24(1)：36-38.

[8] 赵明，沈国清，陆贻通,等.低剂量吡虫啉对异色瓢虫的Hormesis效应及其抗氧化酶活性的影响[J].扬州大学学报:农业与生命科学版，2012，33(4)：77-80.

[9] 岳雷,周忠实,刘志邦,等.不同强度快速冷驯化对广聚萤叶甲成虫耐寒性生理指标的影响[J].昆虫学报,2014,57(6)：631-638.

[10] 王满囷,李周直.滞育期间鞭角华扁叶蜂保护酶系统活力[J].林业科学,2002,38(4)：100-104.

[11] 曹传旺,高彩球.昆虫生化与分子生物学实验技术[M].哈尔滨:东北林业大学出版社,2009：51-52.

[12] 查黎春,胡春祥,曹传旺,等.3种农药对天幕毛虫超氧化物歧化酶活性的影响[J].东北林业大学学报,2011,39(5)：105-107.

[13] 窦俊辉,喻树迅,范术丽,等.SOD与植物胁迫抗性[J].分子植物育种，2010,8(2)：359-346.

[14] 李健男,夏润玺,刘勤,等.柞蚕血液过氧化氢酶(CAT)活性的研究[J].沈阳农业大学学报,2000,31(4)：337-339.

[15] 杨光平,刘玉娣,侯茂林.二化螟滞育幼虫的蛋白和核酸含量以及保护酶活性的变化[J].昆虫学报,2013,56(3)：251-256.

[16] 刘流,贺莉芳,刘晖,等.滞育家蝇幼虫氨基酸、SOD、CAT的变化[J].四川动物,2009,28(4)：579-581.

[17] 方允中,李文杰.自由基与酶基础理论及其在生物学和医学中的应用[M].北京:科学出版社, 1989.

The Changes of SOD and CAT Activity ofHarmoniaaxyridisbefore Natural Wintering in the Maoershan Mountain

DING Xiao-xia, WANG Shi-xin, JIANG Dun, MENG Zhao-jun*et al

(College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040)

[Objective] The changes of SOD and CAT activity were researched forHarmoniaaxyridisbefore natural wintering. [Method]H.axyridiswas regular collected and their SOD and CAT activity were determined by UV spectrophotometer. [Result]The results showed there is no significant correlation to the changes of SOD and CAT activity with temperature, relative humidity and daylength. Then SOD and CAT activity added before November 2, 2013 and added or reduced from November 2 to December 7, 2013. CAT activity was the biggest on November 16, 2013 and was the smallest on December 7, 2013. While SOD activity was bigger on November 2 and December 7, 2013 and was the smallest on November 16, 2013. The complementarity appeared in the changes of SOD and CAT activity. [Conclusion] The results foundedH.axyridisbegan to enter a diapause when it was under 4.8 ℃ and the daylength was less than 10.10 h. Then most ofH.axyridisentered a diapause and wintered when it was -9 ℃ and the daylength was less than 8.70 h. The changes of SOD and CAT activity ofH.axyridiswere significant in the above two points during diapauses and SOD and CAT activity was regarded as the symbol ofH.axyridisentering into diapauses and wintering.

Harmoniaaxyridis(Pallas); Overwintering; Natural population; Catalase(CAT); Superoxide dismutase(SOD)

东北林业大学大学生创新创业训练计划项目(201310225009)。

丁晓霞(1992-)，女，四川双流人，本科生，专业：森林资源保护与游憩。*通讯作者，讲师，博士，从事昆虫化学生态与害虫生物防治研究。

2014-11-25

S 718.7

A

0517-6611(2015)02-144-04