槲皮素氧化前后对果蝇寿命和抗氧化活性的影响

李金娣，武亦珂，武啸剑

(1.洛阳市精神卫生中心，河南洛阳 471013；2.河南海丝克生物科技股份有限公司，河南洛阳 471000 )



槲皮素氧化前后对果蝇寿命和抗氧化活性的影响

李金娣1，武亦珂2，武啸剑2

(1.洛阳市精神卫生中心，河南洛阳 471013；2.河南海丝克生物科技股份有限公司，河南洛阳 471000 )

[目的] 探讨槲皮素氧化前后对果蝇寿命和抗氧化活性的影响。[ 方法] 以果蝇为试材，培养基添加氧化前后的槲皮素，(25±1)℃下培养5 d后转移到(33±1)℃下培养到全部死亡，期间取材测定。分别采用氮蓝四唑(NBT)法、硫代巴比妥酸(TBA)法、流动注射化学发光方法和HPLC法，测定不同天数的果蝇体内超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、羟自由基的清除率及其体内槲皮素的含量。 [结果] 果蝇寿命和抗氧化活性是以槲皮素、氧化槲皮素、对照的顺序递减。[结论]光照、高温和高湿的环境使得槲皮素的抗氧化活性降低。

槲皮素；抗氧化活性；清除自由基；HPLC；流动注射化学发光

槲皮素广泛分布在壳斗科、小檗科、金丝桃科、夹竹桃科等植物中，并且在日常食物也比较常见，比如在洋葱、苹果、茶叶、红酒、花椰菜和银杏中含量较高[1]。槲皮素具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤作用，还有心血管系统保护作用。除具有以上药理作用外，还具有降糖、止泻、镇痛[2]、抗血栓、抗肥胖、抗抑郁等作用。因此，槲皮素不仅可以作为药物应用于人体预防和治疗疾病，而且可以作为食品和化妆品添加剂，防止食品和化妆品氧化。

近年来，随着人们物质生活水平的提高，人们对健康指数的要求也越来越高，因此抗氧化抗衰已成为人们关注的热点。基于槲皮素的这些生物活性，其抗氧化活性成为人们的研究重点。槲皮素作为一种活性高、纯天然的抗氧化剂用于食品和化妆品中，避免了合成抗氧剂如丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、没食子酸丙酯(PG)等带来的副作用[3]。在这些含有槲皮素的药品和含有槲皮素添加剂的食品、化妆品中时常可以见到有用透明玻璃瓶子存放、暴露于光线下面甚至夏季置于高温的地方。如此 放置和储存含芦丁的药物、食品和化妆品使得槲皮素的生物活性尤其是抗氧化性是否一致尚不清楚。因此，以模式动物——果蝇作为研究对象，对其体内超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、槲皮素含量进行测定，进一步利用流动注射化学发光法对果蝇体内羟基自由基清除率进行测定，阐述槲皮素氧化前后抗氧化活性的一致性。

1 材料与方法

1.1 材料槲皮素标准品(图1)在-20 ℃避光保存；将槲皮素标准品置于(30±1) ℃恒温、相对湿度(RH) 60%条件下光照6个月。光照处理下槲皮素颜色的变化见图2。供试动物为野生型红眼灰身长翅果蝇。

1.2 方法

1.2.1培养基的制备。对照为基本培养基[4]，组成为玉米粉、蔗糖、琼脂、酵母粉、苯甲酸钠；处理①在对照基本培养基中添加质量百分数0.01%的槲皮素；处理②在对照基本培养基中添加质量百分数0.01%的氧化槲皮素。

1.2.2给药及分组。收集8 h内羽化未交配的果蝇，雌雄分开，分6组，每组3瓶，每瓶约150只，每5 d更换一次培养基。试验第1阶段在室温(25±1) ℃，试验第2阶段(6～13 d)在高温(33±1) ℃、RH 60%条件下饲养，并且每天定时统计果蝇死亡数目，直至全部死亡。

1.2.3SOD活性测定。采用NBT法[5-6]。取雌或雄果蝇20只，置于预冷的研钵中，加磷酸缓冲液3 ml，研成匀浆，在 4 ℃、6 000 r/min下离心10 min，然后取上清液 0.2 ml，依次加SOD混合液5.8 ml，25～35 ℃光照反应10 min。测定结果以每克果蝇的SOD活力单位数表示(U/g)。

1.2.4MDA含量测定。采用硫代巴比妥酸(TBA)法[5]。取雌或雄果蝇50只，置于预冷的研钵中，加浓度10%三氯乙酸(TCA)，研成匀浆，在常温4 000 r/min下离心20 min，然后取上清液 0.25 ml，加浓度0.6%硫代巴比妥酸(TBA)，沸水浴15 min，冷却后在波长450、532、600 nm处测其吸光值。测定结果以每克匀浆含MDA摩尔数表示(mol/g)。

1.2.5类黄酮对羟自由基清除率的测定。Fe2+、亚甲基蓝、过氧化氢及水通过相应管路输入流动注射化学发光分析系统，记录化学发光强度为I0；以样品溶液代替水，记录化学发光强度为Is，发光强度的降低值ΔI作为清除羟自由基的度量。清除率(E)计算公式[7]为：

E= (ΔI/I0)×100%

(1)

1.2.6HPLC测定槲皮素。

1.2.6.1测定条件及标准曲线的制作。精密称取槲皮素对照品10 mg，以甲醇溶解并定容至10 ml，得对照品储备液。分别吸取槲皮素的储备液0.01、0.05、0.10、0.30、0.50 ml于10 ml棕色容量瓶中，用甲醇定容至10 ml[8]。LC-20A高效液相色谱仪的色谱条件为：色谱柱Shim-pack VP-ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温35 ℃，流动相为甲醇∶浓度1%乙酸为60∶40，紫外检测器，检测波长360 nm，流速1.0 ml/min。依据峰面积绘制标准曲线，其回归方程为:

Y=3.180×107X-161 536.799

(2)

式中，Y为峰面积，X为浓度(mg/ml)。

1.2.6.2果蝇体内槲皮素含量测定。取果蝇30只，置于研钵中，加1 ml 流动相研磨，将匀浆置于室温、8 000 r/ min离心20 min，然后取上清液。处理①和处理②按照0.1 mg/ml槲皮素标准溶液∶果蝇上清液1∶3的比例处理样品，得到处理①和处理②样品。对照组按照上述的槲皮素标准溶液∶果蝇上清液1∶3的比例处理样品，得到对照样品。在上述色谱条件，测定对照样品Ax以及处理①、处理②样品As。

△c=△s(处理样品)-△x(对照品)

(3)

含量(%)=△c×V/M×100%

(4)

利用外标法计算果蝇体内槲皮素的含量。

2 结果与分析

2.1 槲皮素和氧化槲皮素对果蝇寿命的影响在(25±1) ℃下饲养1～5 d，处理①、处理②和对照组果蝇基本无明显死亡。在(33±1) ℃下饲养6～9 d，果蝇死亡数明显增加，直至13 d果蝇全部死亡。这符合方程Y=aX3+bX2+cX+d。

由图3、4和表1可知，处理①、②和对照果蝇剩余50%时的天数分别是雌性8.27、7.80和7.46，雄性9.00、7.89和7.70。可见，槲皮素或氧化槲皮素的添加对寿命均有所延长，但是前者更加明显。

表1 不同处理下果蝇寿命标准曲线及其相关系数

2.2 槲皮素和氧化槲皮素对果蝇体内SOD和MDA的影响由表2可知，25 ℃培养1 d时，对照、处理①和处理②的雄性SOD活性分别是各组内雌性的1.7、1.1和1.4倍，可见雄性均大于同组雌性，说明在同样条件下雄性SOD活性大于雌性。其次，处理①、处理②的雌性和雄性SOD活性分别是对照组雌性的4.6、3.2倍和雄性的3.0、2.7倍，差异在0.01水平显著，说明只要添加槲皮素，SOD均有明显增加。第三，处理①和处理②相比，后者略有降低。到了第5天，变化不大，但是与1 d相比，对照的雌、雄性和处理②的雌性SOD活性分别增加了3.2、2.2和1.3倍。

33 ℃培养1 d时，对照、处理①和处理②的雄性SOD活性分别是各组内雌性的2.5、1.1和1.7倍，可见雄性均大于同组雌性，说明在同样条件下雄性SOD活性大于雌性。其次，处理①、处理②的雌性和雄性SOD活性分别是对照组雌性的3.8、2.2倍和雄性的1.6、1.4倍，差异在0.01水平显著，说明高温能够加速机体的衰老，但是添加槲皮素后SOD活性均有明显增加。第三，处理①和处理②相比，后者略有降低。与25 ℃培养1 d时相比，对照的雄性SOD活性增加了1.5倍，处理①和处理②的SOD活性均降低；到了第2天，对照、处理①和处理②的雄性SOD分别是各组内雌性的3.8、1.6和3.0倍，可见在同样条件下雄性SOD活性大于雌性。其他基本变化不大。

表2 槲皮素和氧化槲皮素对果蝇体内SOD活性的影响 U/g

注：处理①、处理②与对照比较为a、b；处理①与处理②比较为c；同组内雄雌比较为d；与1d比较为e。小写为P<0.05；大写为P<0.01。

由表3可知，随着时间的增加，MDA含量呈上升趋势；处理①、处理②MDA含量低于对照组，处理①最为显著。低含量的MDA说明果蝇抵抗自由基能力较高，可见添加槲皮素和氧化槲皮素后，果蝇的抗氧化能力提高。在(25±1) ℃下饲养1～5 d，处理①和处理②的果蝇体内MDA含量低于对照，并且随时间的增加而降低。(33±1) ℃环境饲养6～8 d中，随着时间的增加，对照的果蝇体内MDA含量逐渐增加，说明高温环境会加速果蝇的衰老。处理①和处理②的果蝇体内MDA含量也逐渐降低，处理①效果最为显著，说明槲皮素对雌果蝇的抗自由基能力显著。

注：处理①与对照相比较，不同小写字母表示差异在0.05水平显著。

表4 槲皮素和氧化槲皮素对果蝇体内羟自由基清除率 %

2.3 槲皮素和氧化槲皮素对果蝇体内羟自由基清除率的影响在制备果蝇培养基前，对槲皮素和氧化槲皮素清除羟自由基的能力进行了测定。由图5可知，槲皮素和氧化槲皮素清除率分别是55.58%±0.30%(100%)和52.98%±0.97%(95%)，后者的清除率降低了5%，颜色也有改变。

由表4可知，随着时间的增加，处理①、处理②对果蝇体内羟自由基清除率呈上升趋势，槲皮素对雄果蝇体内羟自由基的清除率更为显著。在(25±1) ℃下饲养1～5 d，处理①和处理②果蝇体内自由基清除率随时间的增加而降低。这说明随着时间的增加果蝇机体在逐渐衰老。(33±1) ℃环境饲养6～8 d中，随着时间的增加，处理①和处理②的果蝇体内自由基清除率逐渐增加，说明槲皮素和氧化槲皮素具有清除体内自由基的作用，延缓果蝇机体的衰老。

2.4 不同处理果蝇体内槲皮素的含量利用外标法得到标准曲线Y(mg/ml)= 3.180×107X-161 536.799。对槲皮素和氧化槲皮素的含量分别是0.100 7和0.098 8 mg/ml。依次对25、33 ℃处理①、②的果蝇进行体内槲皮素含量的测定。由表5可知，处理①果蝇体内槲皮素含量高于处理②。

表5 不同处理下果蝇体内槲皮素的含量 mg/kg

3 讨论

果蝇作为模式动物，具有生存周期短、繁殖量大、饲养简便、反应灵敏等优点，其代谢系统、生理功能、生长发育与哺乳动物基本相似。另外，果蝇体内存在和人类相似的衰老基因，在进行药物筛选、药物毒理和抗衰老等方面的研究时，可将其作为一种很好的实验材料[9-12]。槲皮素可以延缓衰老。这已得到多方面试验的证实。其抗氧化性体现在抗衰老药物方面，并且已作为添加剂被广泛用于食品和化妆品领域。

研究表明，槲皮素和氧化槲皮素均可延长果蝇寿命，使果蝇体内SOD活性增强，MDA含量降低，增强对体内羟自由基的清除率。其次，槲皮素的抗氧化效果比氧化槲皮素更显著。第三，当进行果蝇体内槲皮素含量测定时，处理①含量大于处理②。可见，光照、高温和高湿的环境使得槲皮素的抗氧化活性降低，随着时间的增加，其抗氧化活性的药效逐渐降低。

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Effects of Inoxidized and Oxygenated Quercetin on the Life-span of Drosophilae and the Antioxidant Activity

LI Jin-di1, WU Yi-ke2, WU Xiao-jian2

(1.Louyang Mental Health Center, Louyang, Henan 471013; 2. Hennan Health Care Biotechnology Co. Ltd, Luoyang, Henan 471000)

[Objective] The aim was to discuss the effect of inoxidized and oxygenated quercetin on life-span and the antioxidant activity. [Method] With Drosophila melanogaster as the tested material, they were placed on the medium made by quercetin and oxygenated quercetin to be cultured at (25±1)℃ for 5 days. After that transfer them to (33±1)℃ until death wholly and we drawn them to determine. NBT method, TBA method, the flow injection chemiluminescence method and the HPLC method were used to determine the superoxide dismutase (SOD) activity, the malondialdehyde (MDA) content, the scavenging effect of hydroxyl radical and the content of rutin in D. melanogaster on different days. [Result] In order of quercetin, oxygenated quercetin, control, the life-span and the antioxidant activity of Drosophila melanogaster were decreased.[Conclusion]Light,high temperature and high humidity environment could reduce the antioxidant activity of quercetin.

Quercetin; Antioxidant activity; Scavenging free radicals; HPLC; Flow injection chemiluminescence

国家自然科学基金(31060193)；桂林理工大学科研启动费。

李金娣(1985-)，女，河南洛阳人，药师，硕士，从事临床药学方面的研究。

2014-11-28

S 853.7

A

0517-6611(2015)02-009-03