苦荞黄酮转运相关蛋白基因FtAH4L的克隆及表达分析

赵经昊，李成磊，姚慧鹏，陈 惠，赵海霞，吴 琦

（四川农业大学生命科学学院，四川雅安625014）

苦荞黄酮转运相关蛋白基因FtAH4L的克隆及表达分析

赵经昊，李成磊，姚慧鹏，陈 惠，赵海霞＊，吴 琦

（四川农业大学生命科学学院，四川雅安625014）

为研究苦荞黄酮转运相关基因，以苦荞（Fagopyrum tataricum）品种“西荞二号”为材料，克隆到1条质膜H＋－ATPase基因（autoinhibited H＋－ATPase isoform4 like，AH4L），将其命名为FtAH4L。通过开放阅读框（ORF）分析，FtAH4L基因cDNA全长3 398bp，开放阅读框2 898bp，编码966个氨基酸残基，理论分子量为109 kD，等电点6.48。氨基酸保守基序比对分析表明，AH4L在植物种间较为保守。在茉莉素诱导处理和5种光（白色荧光、LED白光、LED蓝光、LED红光和UV－B）处理芽期苦荞后，采用半定量RT－PCR和AlCl3比色法分析结果表明，茉莉素处理后的苦荞胚轴和子叶中FtAH4L基因表达量与黄酮含量均显著上升，且二者呈正相关关系；5种光对子叶中FtAH4L表达量无显著影响，但均显著增加其黄酮含量；胚轴中，除LED红光外，各种光均显著提高FtAH4L表达量和总黄酮含量，且LED蓝光与UV－B的影响极显著。该研究结果为深入研究FtAH4L基因参与苦荞黄酮转运奠定了基础。

苦荞；质膜H＋－ATPase基因；基因表达；黄酮含量

黄酮化合物是植物中一大类重要的次生代谢产物，由细胞质多酶复合体合成后，可在位于生物膜上的各类转运蛋白帮助下进行胞内跨膜或长距离运输［1］。现已了解的黄酮转运主要依赖以下3种类型：ABC－Type类型的转运体（ATP binding cassette－Type transporters）［2］，MATE型转运体（MATE－Type transporters）［3］和质子依赖型转运（proton－dependent transporters）［4］。其中，质膜H＋－ATPase类蛋白通过建立的跨膜质子电动势，带动其它次级运输体参与原花青素和黄酮醇的运输［5］。H＋－ATPase是植物细胞的“主宰酶”，由它建立的跨膜质子电动势是物质跨膜运送的原初动力。近年研究发现，干旱、低温、盐渍和射线辐照等逆境都影响H＋－ATPase的活力，并认为该酶活力的变化是植物伤害的原初位点［5］，质子依赖型转运体按亚细胞定位的结果大致分为定位于细胞质膜的P－type H＋－ATPase，以及细胞内膜上的V－type H＋－ATPase和焦磷酸酶（PPase）3种，其中P－type H＋－ATPase参与了逆境胁迫下生物膜上的反应［6］。AHA10（Arabidopsis thaliana autoinhibited H＋－ATPase isoform 10）是拟南芥（Arabidopsis thaliana）中P－type ATPase家族的一员，AHA10基因的缺失导致花青素在相应的突变体的种皮中不能积累，说明定位于细胞内膜系统的P－type H＋－ATPase与植物黄酮转运存在着相关性［7］。

苦荞（Fagopyrum tataricum）为食药两用植物，含有丰富的黄酮类化合物［8］，对人体具有降脂、降糖和抗氧化等药理作用和生理功能［9］。以芦丁为代表的黄酮，主要在苦荞萌发阶段的子叶（5%～6%）［10］和花期的花蕾（6.0%～6.5%）［11］中积累，参与抵抗UV－B辐射、抗寒、抗旱等生理过程［12－14］，无论是正常生长或受到环境胁迫，子叶中的黄酮含量均高于胚轴，但二者黄酮合成相关基因表达水平却并不如此，即不同组织器官黄酮含量与黄酮相关合成酶基因表达水平并非线性相关，提示在苦荞中存在黄酮跨膜运输机制［15］。本研究以高黄酮苦荞栽培种“西荞2号”为材料，克隆其H＋－ATPase基因的cDNA，分析在茉莉素和不同光处理后，芽期苦荞子叶和胚轴中H＋－ATPase基因的表达与总黄酮含量，研究该酶在苦荞黄酮转运中的分子调控机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料及处理

“西荞二号”苦荞种子购自西昌学院，种植于四川农业大学生命科学学院实验田，在花期取新鲜幼嫩叶片提取RNA，用于FtAH4L基因的克隆。

2013年11月，参照赵海霞等［16］的方法萌发苦荞种子。将苦荞种子置于40℃蒸馏水中浸泡30 min，均匀铺在盖有滤纸的培养皿中并保持滤纸湿润，25℃暗室萌发。种子萌发2d后，选长度为1 cm的苦荞芽，移植在新培养皿中并覆盖1cm厚细砂。于光照培养箱光照条件下25℃培养14h，黑暗条件下18℃培养10h，并保持相对湿度60%。

参照杨文杰等［17］和Suzuki等［18］的方法，选取萌发8d长势相近的芽期苦荞为材料，将终浓度为100μmol／L的茉莉素（jasmonates，JAs）水溶液每30min均匀喷洒1次，分别收集处理0、2、4、6、8和10h后的子叶和胚轴备用。选取萌发6d长势相近的芽期苦荞为材料，在以下光照条件下分别进行培养：黑暗培养；强度为0.1MW／cm2的UV－B（385nm）照射；白色荧光（F）、LED白光（W）、LED红光（R）和LED蓝光（B）照射，光强保持在（50±5）μmol·m－2·s－1；光照12h／d，连续处理3d后，分别收集子叶和胚轴备用。

1.2 实验方法

1.2.1 苦荞叶片总RNA提取和cDNA第一链制备

称取苦荞新鲜叶片2.0g，以植物RNAout试剂盒提取总RNA，电泳检测其完整性。采用逆转录试剂盒（RevertAidTMFirststrand cDNA Synthesis Kit）将总RNA逆转录获得cDNA模板，分装后置于－80℃保存。

1.2.2 苦荞H＋－ATPase基因的克隆 根据NCBI中拟南芥及其他被子植物的质膜H＋－ATPase基因AHA10（AT1G17260）的同源比对结果，设计简并引物AHAjb－f和AHAjb－r（表1），以cDNA为模板，使用高保真DNA聚合酶pfu进行PCR扩增获得苦荞H＋－ATPase基因保守序列片段。反应参数为：94℃预变性4min；94℃变性50s，58℃退火45 s，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃继续延伸10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，回收清晰条带加A尾经T载体克隆，筛选阳性转化子送上海立菲生物技术有限公司测序。根据测序结果，设计特异引物ftAH5－1、ftAH5－2进行5′－RACE，使用特异引物ftAH3－1、ftAH3－2和ftAHN3－3进行3′－RACE。根据5′－RACE和3′－RACE测序结果拼接获得苦荞H＋－ATPase基因全长cDNA序列，设计特异引物ftAH4L－f和ftAH4L－r扩增其ORF序列。

1.2.3 生物信息学分析 采用DNAman（Version5.22）将得到的核苷酸序列推导为氨基酸序列，采用NCBI数据库的Blast－p（http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）进行同源比对，采用Clustal X（1.8）进行基于氨基酸序列的多重序列比对，SOPMA（http：／／npsa－pbil.ibcp.fr／cgi－bin／npsa＿automat.pl？page＝／NPSA／npsa＿seccons.html）进行二级结构分析，结合PSIPRED（http：／／bioinf.cs.ucl.ac.uk／）预测蛋白质跨膜区，采用SWISSMODEL（http：／／beta.swissmodel.expasy.org／）数据库进行三维同源建模，采用MEGA6.0构建系统发育树。

1.2.4 FtAH4L表达量分析和总黄酮测定 参照吴琦等［19］的方法采用半定量RT－PCR（semi－quantitative RT－PCR），使用引物ftAHAs－f和ftAHAs－r检测FtAH4L在苦荞子叶和胚轴中的表达量，以引物ft H3sm－f和ft H3sm－f检测持家基因H3的表达量为内参（表1）。利用凝胶成像系统扫描电泳结果，以FtAH4L与H3的光密度值比值（optical intensity of FtAH4L／optical intensity of FtH3）来表示FtAH4L相对表达量。

采用AlCl3法［18］测定总黄酮，在420nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线，拟合回归方程，并计算相关系数。苦荞子叶和胚轴样品冷冻干燥置至恒重，研磨样品至粉末，精确称量0.100g样品至10 mL离心管中，加入3mL 65%乙醇并使用封口膜密封。使用超声波细胞破碎仪，以15%的输出功率超声20min提取总黄酮。12 000r／min离心5min后转移上清至另一离心管中，再次加入2mL 65%乙醇，继续超声10min。12 000r／min离心5min后转移并合并上清，使用等体积石油醚萃取排除叶绿素干扰，反复萃取至石油醚为无色透明后，使用分液漏斗分离并收集下层液体并使用0.45μm有机相滤膜过滤，所得样品即为苦荞总黄酮提取液。测定样品OD420，对照标准曲线求得苦荞组织中总黄酮含量（%）。

1.2.5 数据的分析和处理 用SPSS19.0软件进行Duncan多重比较及显著性检验，同时进行双变量Pearson相关性分析。

2 结果与分析

2.1 苦荞H＋－ATPase基因的克隆

使用简并引物AHAjb－f和AHAjb－r扩增H＋－ATPase基因保守片段，获得1条长度约为750bp的特异片段（图1，A）。测序结果表明，该片段长813bp，与其他植物H＋－ATPase具有77%～84%的同源性。使用特异引物ftAH5－1和ftAH5－2进行5′－RACE，得到1条长约750bp的特异条带（图1，B）。使用特异引物ft AH3－1、ft AH 3－2和ftAHN3－3进行3′－RACE，得到1条约1 800bp的特异条带（图1，C）。将保守片段序列与5′－RACE和3′－RACE测序数据进行拼接，根据拼接结果设计的特异引物ftAH4L－f和ftAH4L－r扩增苦荞H＋－ATPase基因ORF，获得1条约3000bp的特异条带（图1，D）。序列分析表明，苦荞ATPase基因的cDNA序列全长3 398bp，其ORF为2 898 bp，5′－UTR为170bp，3′－UTR为331bp并包含25 bp的Poly A尾，将该基因命名为FtAH4L，Gen－Bank登录号为KF955601。

2.2 苦荞FtAH4L的序列分析与系统发育树

2.2.1 苦荞FtAH4L序列分析 DNAman分析表明，FtAH4L基因编码1个966氨基酸残基的蛋白FtAH4L，分子量109kD，等电点6.48。BlastP同源比对表明，该序列与其他植物FtAH4L蛋白一致率在97%以上。选取双子叶植物拟南芥、单子叶植物玉米（Zea mays）和人类（Homosapiens）的质膜P－typeATPase蛋白与FtAH4L氨基酸序列进行序列多重比对，表明其含有ATPase特异的基序：磷酸酯酶膜转导区TGE基序、磷酸化作用区DKTGT基序、连接ATP结合区与参加阳离子结合和转导跨膜区保守功能域MXGDGXNDXP结构（图2）。SPOMA分析表明，FtAH4L二级结构中含有10个α螺旋组成的跨膜区，10个α螺旋与4个β片层加上一些无规则卷曲组成了该蛋白包含底物结合位点在内的活性中心。三维同源建模结果表明（图3），FtAH4L蛋白的三维结构与Swiss－Model蛋白质数据库中拟南芥auto－inhibited H＋－ATPase 2（AHA2）相似度最高，具备典型的P－type H＋－ATPase特征。FtAH4L的三维结构主要由跨膜区结构区（transmembrane domain）与细胞质功能域（cytoplasmic domain）即ATP结合功能域（ATP binding domain，ATP－BD）组成。前者为质子进出的通道，后者则由大小2个细胞质环组成。小的细胞质环有2个螺旋，为能量传动区A（actuator domain，A－domain），控制阳离子的结合与释放；大的细胞质环包括了磷酸化功能域P（phosphorylation domain，P－domain）和核酸结合区N（nucleotide binding domain，N－domain）。预测结果表明FtAH4L属于典型的质膜P－typeATPase蛋白。

2.2.2 FtAH4L系统进化树分析 选取GenBank数据库中被子植物P－type H＋－ATPase的蛋白序列，采取MEGA6软件的邻接法重复10000次构建基于氨基酸序列的系统进化树（图4）。结果表明，该系统进化树可以分为3个簇。其中ClusterⅢ主要由单子叶植物的P－type H＋－ATPase组成，FtAH4L被聚类至ClusterⅢ，并显示与玉米的亲缘关系最近。ClusterⅠ包含了大部分双子叶植物的P－type ATPase，ClusterⅡ由包括拟南芥在内的3种双子叶植物所组成。

2.3 茉莉素对苦荞FtAH4L表达及黄酮含量的影响

芽期苦荞经茉莉素连续处理10h，FtAH4L的表达量分析表明（图5，A），处理后FtAH4L表达量比对照（0h）均极显著提高（P＜0.01）。子叶中，FtAH4L表达对茉莉素诱导应答强烈，处理仅2h后其表达量就超过对照的2.5倍，相对表达量达到302%，然后下降至6h的193%，随后迅速上升并稳定在300%左右。胚轴中，处理2h后，FtAH4L表达量上升至对照的近1.3倍，相对表达量的296%，并于6h达到最高（370%），随后下降至10h的300%。黄酮含量测定表明（图5，B），茉莉素诱导下，芽期苦荞子叶和胚轴中黄酮含量均表现为随时间逐步升高，并于10h达到最大值，子叶中黄酮含量为诱导前的1.3倍（P＜0.01），胚轴中则为处理前的15倍（P＜0.01）。相关分析表明，芽期苦荞子叶与胚轴FtAH4L表达量与黄酮含量均呈正相关，子叶和胚轴中的相关系数分别为0.655和0.678。

2.4 光照对苦荞FtAH4L表达及黄酮含量的影响

以黑暗为对照，采用白色荧光、LED白光、LED红光、LED蓝光和UV－B光照处理芽期苦荞，FtAH4L表达量分析表明（图6，A）：胚轴中，FtAH4L表达量仅在LED红光组显著降低（P＜0.05），为对照组的94%，在其他光照下都显著升高，其中在LED蓝光和UV－B组为极显著增加（P＜0.01），相对表达量达到307%和354%。子叶中，FtAH4L表达量在所有光处理组均无显著变化。FtAH4L在胚轴中的表达量都显著高于子叶，表明其表达具有组织特异性。黄酮含量测定表明（图6，B），所有光照组胚轴与子叶黄酮含量均显著上升。其中，LED蓝光和UV－B组呈极显著升高，子叶黄酮含量为对照的1.4倍和2.0倍，胚轴黄酮含量则高达对照的2.7倍和5.9倍。可见，各种光照下苦荞子叶FtAH4L表达量与黄酮含量无明显相关，但胚轴FtAH4L表达量与黄酮含量具有正相关性。

3 讨 论

已有研究表明，在正常生理条件［16］或在各种处理条件下［25］，苦荞胚轴中黄酮合成途径相关酶基因表达量无论比子叶中高还是低，其黄酮含量均显著低于子叶，这可能与黄酮在苦荞中的累积特点相关，即苦荞胚轴中合成的黄酮可被转运到子叶［26］。本研究中，在茉莉素和各种光处理芽期苦荞前后，胚轴FtAH4L表达量均不同程度高于子叶，但子叶黄酮含量均显著高于胚轴（P＜0.05），也支持上述观点。此外，在苦荞胚轴中，FtAH4L基因的表达不仅对茉莉素，而且对蓝光和紫外光均具有强烈的响应；而在苦荞子叶中，FtAH4L基因的表达仅对茉莉素具有强烈的响应。该现象提示，苦荞胚轴与子叶中可能存在两套不同的非生物胁迫响应机制，进而导致其黄酮积累过程和机制的差异。

目前，尽管对于植物黄酮胞内转运、跨膜转运及其调控机制的了解甚为有限，但随着基因组共表达微阵列分析和突变体等分子遗传学分析的深入，将有助于揭示膜转运蛋白在代谢流调控中的重要作用［27］。本研究拟进一步分析苦荞在各种逆境胁迫条件下，FtAH4L基因表达模式及与各种黄酮化合物含量和组织分布规律，以加深对苦荞黄酮胚轴和子叶黄酮转运和积累机制的理解。

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（编辑：宋亚珍）

Cloning and Expression Analysis of Flavonoids Transporter Gene FtAH4LfromFagopyrum tataricum

ZHAO Jinghao，LI Chenglei，YAO Huipeng，CHEN Hui，ZHAO Haixia＊，WU Qi
（College of Life Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an，Sichuan 625014，China）

The gene FtAH4L，which encoding the autoinhibited H＋－ATPase isoform 4like（AH4L）involved into flavonoids transportation，was cloned from tartary buckwheat cultivar Xiqiao No.2（Fagopyrum tatarium）.The length of FtAH4Lgene was 3 398bp，and the ORF（Open Reading Frame）was 2 898bp encoding 966amino acids.The molecular weight of FtAH4Lwas 109kD，and its pI was 6.48.Conserved motifs and phylogenetic analysis demonstrated that AH4Ls are relatively conservative in different plant species.At the seedling stage of tartary buckwheat，semi－quantitative RT－PCR analyzed the expression profiles of FtAH4Lgene，and AlCl3colorimetric method measured the total flavonoids content in cotyledons and hypocotyls，after jasmonates treatment and different lighting（White fluorescent，LED White，LED Blue，LED Red and UV－B）.The results showed that FtAH4Lexpression and flavonoids content not only had a significant increase（P＜0.05），but also showed a positive correlation in cotyledons and hypocotyls after jasmonates treatment.Under all the lightings，FtAH4Lexpression was unremarkable change（P＞0.05）while flavonoids content was raised obviously in cotyledons.However，in hypocotyls，FtAH4Lexpression and flavonoids content were promoted notably（P＜0.05）except LED Red.Particularly，LED blue and UV－B presented the extremely significant affect（P＜0.01）.This work could provide an important reference to understand the mechanism of FtAH4Lgene involved in flavonoids transportation in tartary buckwheat.

Fagopyrum tataricum；plasma membrane H＋－ATPase gene；gene expression；flavonoids content

Q785；Q786

A

1000－4025（2015）08－1511－07

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.08.1511

2015－04－12；修改稿收到日期：2015－06－23

四川省教育厅青年基金（14ZB0008）

赵经昊（1988－），男，在读硕士研究生，主要从事植物分子生物学研究。E－mail：ayanami＿rei2＠163.com

＊通信作者：赵海霞，副研究员，主要从事资源植物分子生物学研究。E－mail：zhaohaixia197708＠163.com