‘砀山酥梨’及其褐皮芽变果皮中多胺类物质含量和相关基因表达分析

孙虹丽，王子腾，蒋向红，贾 兵，刘 莉，叶振风，衡 伟，朱立武

（安徽农业大学园艺学院，合肥230036）

‘砀山酥梨’及其褐皮芽变果皮中多胺类物质含量和相关基因表达分析

孙虹丽，王子腾，蒋向红，贾 兵，刘 莉，叶振风，衡 伟，朱立武＊

（安徽农业大学园艺学院，合肥230036）

为研究多胺类物质在‘砀山酥梨’芽变品系‘锈酥’果皮褐色形成中的作用，以‘砀山酥梨’和‘锈酥’花后不同时期果皮为试材，采用HPLC方法测定果皮中多胺类物质的含量，利用RACE技术克隆多胺合成过程中的关键基因，通过Protparam网站与MEGA5.0软件分析相关基因蛋白的理化性质及其系统进化，用荧光定量qRT－PCR方法分析不同时期果皮中相关基因的相对表达量。结果表明：（1）除花后50和150d外，其它时期‘砀山酥梨’果皮中腐胺含量均显著高于‘锈酥’，花后50d、75d、150d时，‘锈酥’果皮中的亚精胺、精胺含量显著高于‘砀山酥梨’果皮。（2）克隆出多胺合成的基因ADC、SPDS和SPMS（GenBank登录号分别为KM923903、KM923905和KM923906），预测ADC和SPMS均为水溶性蛋白、SPDS为疏水性蛋白，它们与苹果的亲缘关系最近。（3）荧光定量PCR结果显示，花后50d，多胺合成中ADC、SPDS和SPMS在‘锈酥’果皮中表达量均显著高于‘砀山酥梨’。研究推测，‘锈酥’果皮中多胺代谢及相关基因的上调表达可能与‘锈酥’的果皮褐色形成有关。

梨；褐皮芽变；多胺；基因克隆；实时荧光定量

梨属植物（Pyrus spp.）种质资源按果皮颜色分为绿皮梨（包括绿色、黄色、绿黄色、黄绿色）、褐皮梨（包括绿褐色、黄褐色、红褐色、褐色等）和红皮梨（包括部分着色、全面着色）3种类型［1］。‘锈酥’为‘砀山酥梨’的芽变品系，二者果皮颜色存在明显差异，成熟的‘砀山酥梨’的果皮呈现黄色，而‘锈酥’果皮呈现褐色。有研究表明，梨果皮褐色是由于梨果实发育过程中，果皮角质层和表皮细胞破损后形成的木栓积累而造成的［2］，因此推测梨果皮褐色性状变异与果皮木栓成分的合成调控有关。李洪钵等［3］的研究发现，金冠苹果最初的角质层发生龟裂，会深达表皮下的第一层果肉细胞，而形成褐色的木栓组织，逐渐连片成为锈斑。林真二［4］认为，果锈形成的直接原因是由于角质膜的缺失从而导致木栓形成层的发生。吴厚玖［5］认为落花后25d之内是果锈发生的关键期。落花后是细胞分裂和幼果快速增长时期，表皮和下表皮细胞最易受到外界的不良刺激而产生果锈。褐色果皮有助于果实抵抗病虫害和恶劣天气，更耐贮运［6－7］。

多胺（Polyamines，PAs）是存在于原核生物及真核生物中的具有强生物活性的低分子脂肪族含氮碱，是近年来研究较多的一类植物生长发育调节物质。现已在植物体内发现的多胺类物质就有数十种之多，其中以腐胺（putrescine，Put）、亚精胺（spermidine，Spd）、精胺（spermine，Spm）、尸胺（cadaverine，Cad）及鲱精胺（agmatine，Agm）较为普遍［8］。在多胺的合成代谢中，精氨酸先脱去一分子脲生成鸟氨酸，再由鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）催化脱羧，生成Put。在植物和某些微生物体内，精氨酸被精氨酸脱羧酶（arginine decarboxylase，ADC）催化脱羧，生成鲱精胺，再经两步酶促反应，脱去一分子氨，由N－氨甲酰腐胺而生成Put。Put在亚精胺合成酶（spermidine synthase，SPDS）的催化下生成Spd，Spd一方面经精胺合成酶（spermine synthase，SPMS）催化生成Spm，另一方面经热精胺合成酶（thermospermine synthase，ACL5）催化生成热精胺［9］。反应过程中的氨丙基由S－腺苷蛋氨酸脱羧酶（S－adenosylmethionine decarboxylase，SAMDC）催化S－腺苷蛋氨酸（S－adenosyl－L－methionine，SAM）脱羧产生的脱羧S－腺苷蛋氨酸（decarboxylated S－adenosyl－L－methionine，dcSAM）提供。而S－腺苷蛋氨酸的合成酶（S－adenosyl－L－methionine synthase）是S－腺苷甲硫氨酸合成酶催化甲硫氨酸与ATP生物合成的。它是影响Spd和Spm的一个限速酶［10］，在多胺的分解代谢中主要是通过二胺氧化酶（Diamine oxidases，DAO）和胺氧化酶（Polyamine oxidases，PAO）的氧化作用实现的，亚精胺和精胺可在PAO和DAO的催化下产生H2O2［11］。果实发育是高等植物最重要的生命活动之一，多胺在植物细胞内参与细胞分裂、胚胎发生、生根、开花、种子萌发、花粉管伸长、果实形成及成熟、休眠等生理过程［12］；能稳定DNA、RNA结构，加快转录和蛋白质合成，与膜上阴离子基团结合，起稳定膜的作用［13］。目前，有关梨树多胺物质代谢研究较少，涉及梨树多胺物质代谢相关基因的表达研究尚未见报道。

本试验以‘砀山酥梨’和‘锈酥’不同时期果皮为材料，测定了不同时期果皮中Put、Spd、Spm的含量，克隆了多胺合成过程中相关基因ADC、SPDS和SPMS，并分析其在不同时期果皮中表达差异，为研究多胺在芽变‘锈酥’果皮褐色形成中的作用奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 材 料

样品采集于安徽省砀山县园艺场第二分场，植株50年生。2013年花后25、50、75、100、125和150 d，在‘砀山酥梨’和‘锈酥’树冠的东、南、西、北、中部各随机摘取2个果实，每个样品共10个果实，重复3次，0～4℃冷藏保存带回实验室。分别切取厚度约为0.5mm外果皮，液氮速冻处理，混合均匀后保存于－80℃冰箱中备用。

1.2 方法

1.2.1 多胺含量的测定 取梨果皮鲜重0.5g，液氮研磨加入2.5mL预冷的5%高氯酸在冰浴中研磨成匀浆，冰浴浸提1h，于4℃下10 000r／min离心30 min，取500μL上清液加入7μL苯甲酰氯和1mL 2 mol／L NaOH溶液，低速涡旋20s，37℃恒温水浴锅中避光保温25min，然后加入2mL饱和NaCl和2 mL冷乙醚，涡旋20s，4℃下10 000r／min离心5 min，取1.5mL醚相于2mL塑料离心管中，放入烘箱中37℃下避光干燥，若仍有苯甲酰氯味道，再加入250μL冷乙醚吹干，残余物置于－20℃下低温保存备用。色谱柱为ZORBAX SB－C18柱（Agilent 5μm，4.6mm×150mm），柱温为25℃，流动相为甲醇∶水＝75∶25，流速为0.4mL／min。待测样品用100μL 70%甲醇（V／V）溶解，用微孔滤膜过滤（有机系，孔径为0.45μm），过滤后上机测定，进样量为20μL，用外标法定量计算，将标准品Put、Spd和Spm经过苯甲酰化后用100μL 60%甲醇配成一系列浓度，每次进样20μL，用峰面积对进样量做曲线，计算曲线方程和相关系数。

1.2.2 多胺合成中相关基因的克隆 取花后150d果实的果皮进行总RNA提取，采用（StarSpin Plant RNA Mini Kit）RNA提取试剂盒提取，合成引物3′－CDS，采用Promega公司的反转录酶（M－MLV Reverse Transcriptase）合成cDNA，－20℃保存备用。

根据‘砀山酥梨’和‘锈酥’抑制消减文库中得到的ADC、SPDS、SPMS3个差异表达基因部分核苷酸序列设计引物，利用基因特异性引物ADC－5F／ADC－5R、SPDS－5F／SPDS－5R和SPMS－F／SPMSR，以果皮cDNA为模板进行PCR扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析、回收，连接到pGEM－T载体，将含有目标片段的阳性单克隆送至深圳华大有限公司分别测序，得到ADC、SPDS这2个基因的5′端序列及SPMS的全长序列。设计3′－RACE引物ADC－3F1和ADC－3F2，SPDS－3F1和SPDS－3F2，分别和UPM long、NUP进行巢式PCR扩增，克隆出ADC、SPDS这2个基因的3′端序列。根据5′端和3′端的重叠序列利用DNAMAN软件进行拼接，最后获得3个基因的全长序列。本试验所用引物见表1。

1.2.3 基因蛋白理化性质与系统进化分析 利用Protparam网站（http：／／web.expasy.org／prot－param／），预测ADC、SPDS和SPMS这3个基因编码蛋白的理化性质。采用MEGA5.0软件，对预测的ADC、SPDS、SPMS这3个基因氨基酸和NCBI已经登录相关基因的氨基酸序列进行系统进化分析。

1.2.4 多胺合成中相关基因的表达分析 分别以‘砀山酥梨’和‘锈酥’花后25、50、75、100、125和150d果皮总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链，根据获得的ADC、SPDS、SPMS基因的3′端序列，使用Primer premier 5.0设计特异性引物YgADC－F和YgADC－R，YgSPDS－F和YgSPDS－R，YgSPMS－F和YgSPMS－R，以梨Actin基因为内参，引物为Actin－F和Actin－R，3次重复。使用STEPONE荧光定量PCR仪进行定量分析，试剂采用TaKaRa公司的SYBR®Premix Ex TaqTMII，操作按照试剂说明进行，采用2－△△CT公式计算基因相对表达量。本试验中所用引物见表2。

2 结果与分析

2.1 ‘砀山酥梨’与‘锈酥’果皮中3种多胺类物质含量

在花后50d‘砀山酥梨’和‘锈酥’果皮外观无明显差异，花后100d两者果皮色泽开始呈现差别；花后150d两者果皮外观差异显著（图1），此时‘锈酥’不仅果皮褐变加深，果实可溶性糖、可滴定酸含量也显著增高。不同时期果皮中Put含量测定结果显示，在花后各个时期，‘砀山酥梨’和‘锈酥’中Put含量差异均达到显著水平。除花后50和150d外，其它时期‘砀山酥梨’果皮中Put含量均显著高于‘锈酥’（图2，A）。说明果皮中Put提前出现较高的含量，加速了细胞的生理代谢，促进了果皮褐色的形成，增加了果实中可溶性糖、可滴定酸的积累。

Spd含量在花后不同时期，‘砀山酥梨’和‘锈酥’中含量差异均达到显著水平。在‘砀山酥梨’中呈现先降低、再升高、再降低的趋势，在‘锈酥’中呈现先升高、后降低、再升高的趋势。这些可能与前期Put含量的积累有关，在花后50、75和150d，‘锈酥’中的Spd含量要明显高于其在‘砀山酥梨’中的含量，其他时期均是‘砀山酥梨’中的含量高于‘锈酥’中的含量。在‘砀山酥梨’花后100dSpd含量达到最大值，‘锈酥’中在花后75d达到最大值，过高的Spd将有助于后续Spm的形成（图2，B）。

不同时期中的‘砀山酥梨’中的Spm含量呈现先降低、后升高、再降低的趋势，而在‘锈酥’中呈现先升高、后降低、再升高的趋势。在花后50、75和150d，‘锈酥’中的Spd含量要明显高于其在‘砀山酥梨’中的含量，其他时期均是‘砀山酥梨’中的含量高于‘锈酥’中的含量。‘锈酥’在花后75dSpm含量达到最大值，‘砀山酥梨’在花后100dSpm含量达到最大值。除了花后25d，其他时期Spm在‘砀山酥梨’和‘锈酥’中的含量差异均达显著水平，Spd和Spm的变化趋势较相似。在花后50d时，‘锈酥’果皮中Put、Spd、Spm含量都要高于‘锈酥’果皮中的含量，这种趋势在Spd和Spm中一直持续到花后75d，可见花后50～100d是‘砀山酥梨’和‘锈酥’产生差异的关键时期（图2，C）。

根据本实验室前期对‘砀山酥梨’和‘锈酥’不同时期果皮木质素含量的测定数据资料［14］分析，不同时期果皮中多胺的含量与木质素增量呈正相关，但相关关系均未达到显著水平。说明果皮中木质素积累与多胺的含量变化并不同步。

2.2 多胺合成中相关基因的克隆

ADC基因5’端（图3，A）和3’端（图3，B）经过拼接，得到全长cDNA序列2 193bp，编码527个氨基酸，登录号为KM923903；SPDS基因5’端（图3，C）和3’端（图3，D）经过拼接后得全长cDNA序列909bp，编码221个氨基酸，登录号为KM923905；SPMS基因全长cDNA序列1 110bp（图3，E），编码242个氨基酸，登录号为KM923906。

2.3 多胺合成中ADC、SPDS和SPMS基因蛋白理化性质分析

用Protparam预测ADC、SPDS和SPMS基因编码蛋白的理化性质，推测该3个蛋白的分子式分别为S14和C1600H2831N483O533S21，相对分子质量分别为78 436.9、33 113.9和40 439.4，等电点分别为5.23、4.87和5.98。总带负电荷的残基（Asp＋Glu）分别为87、41和46，总带正电荷的残基（Arg＋Lys）分别为58、27和39。亲水性平均数分别为－0.047、0.016和－0.141，预测ADC和SPMS这2个蛋白均为水溶性蛋白，SPDS为疏水性蛋白。

利用MEGA5.0软件Neighbor－Joining方法，将ADC、SPDS和SPMS这3个基因的预测蛋白，与GenBank中已经登录的不同物种相关基因蛋白进行系统进化树分析（图4）。ADC基因预测蛋白的进化树分析中，选择了苹果、梅、川桑、葡萄、毛白杨、野茶树、枳、可可、棉花、蕃茄等，发现ADC基因的预测蛋白与苹果的亲缘关系最近（图4，A）；SPDS基因预测蛋白的进化树分析中，选择了苹果、梅香瓜、川桑、葡萄、黄瓜、毛白杨、野茶树、可可、蓖麻等，发现SPDS基因的预测蛋白与苹果的亲缘关系最近（图4，B）；SPMS基因预测蛋白的进化树分析中，选择了苹果、梅、葡萄、川桑、黄瓜、香瓜、格兰桉、大豆、拟南芥、甘薯等，发现SPMS基因的预测蛋白与苹果的亲缘关系最近（图4，C）。

2.4 多胺合成中ADC、SPDS和SPMS基因的表达分析

花后25和50d时，‘锈酥’果皮中ADC基因的表达量均显著高于‘砀山酥梨’；花后50d‘锈酥’果皮中ADC基因的表达量达到高峰，而‘砀山酥梨’在花后75d达到最大值（图5，A）。幼果发育前期‘锈酥’果皮中ADC基因的上调表达、‘锈酥’果皮中ADC基因表达量高峰期的提早出现，与其果皮中Put提前出现较高的含量相吻合。

在花75d时，SPDS基因在‘砀山酥梨’中的表达量最高，而在‘锈酥’花后50d时表达量最高。在花后25、50、75和100d时，SPDS在‘锈酥’中的表达量均高于在‘砀山酥梨’中的表达量，这与Spd含量在花后75d达到最大值相吻合，SPDS基因在‘砀山酥梨’和‘锈酥’中的表达趋势，与Spd含量在‘砀山酥梨’和‘锈酥’中的变化趋势一致。在花后50和75d时，SPDS在‘砀山酥梨’与在‘锈酥’中的表达量存在显著差异（图5，B）。

SPMS基因在‘砀山酥梨’果皮中的表达量呈现先升高、后降低的趋势，总体变化差异性不大，在‘锈酥’中呈现先升高、后降低的趋势，在花后50d时，SPMS在‘锈酥’中的表达量最高，这与Spm含量的变化趋势一致，说明SPMS基因在控制Spm合成的过程中起着正调控作用。在花后25、50、75和125d时，SPMS在‘锈酥’中的表达量均高于在‘砀山酥梨’中的表达量。在花后25和50d时，SPMS在‘砀山酥梨’与在‘锈酥’中的表达量存在显著性差异（图5，C）。

对ADC、SPDS、SPMS基因的表达量与Put、Spd、Spm含量作相关性分析，结果显示，各基因表达量与相关的多胺含量存在正相关关系，但相关性未达到显著水平。由此可见，基因表达量的上调下调，与其调控的代谢产物的增加或减少，尚存在较复杂的关系。

3 讨 论

从多胺代谢途径可知，多胺在分解代谢中产生H2O2，H2O2参与木质素的合成过程，细胞壁中H2O2会参与多种与胞壁相关的生理过程，如细胞程序性死亡、胞壁木质素的合成和硬化、细胞防御性反应等［15－17］。衡伟等［18］研究发现，花后50和75d，‘锈酥’果皮中的H2O2含量要高于‘砀山酥梨’中的含量。李晓峰等关于‘砀山酥梨’和‘锈酥’研究结果显示，花后75～125d，是‘锈酥’果皮褐色产生的关键时期，其木质素增量要明显高于‘砀山酥梨’，这可能是导致‘锈酥’果皮褐色产生的原因之一［14］。在衡伟等的研究中，‘砀山酥梨’芽变品系‘锈酥’果皮木质素含量的增加、细胞结构的变化、表皮细胞层木栓程度高，是导致锈酥果皮发生褐变的主要原因［19］。

本研究发现，在果实发育初期，Put在‘砀山酥梨’及‘锈酥’中的含量都较高，但随后的时期中又达到一个小高峰，但在花后50d时‘锈酥’果皮中Put含量要明显高于‘砀山酥梨’，而根据多胺在植物中的合成途径可知，在大部分的生物体内，多胺的合成始于Put合成，它是Spd合成过程中的直接底物，它含量的高低会直接影响后续Spd和Spm含量［20］。在果实发育过程中，坐果期细胞分裂旺盛，Put含量会比较高，‘锈酥’中较高Put含量的积累可能更有利于后期果皮中多胺合成。而在花后75d时，Spd和Spm在‘锈酥’果皮中的含量比在‘砀山酥梨’中的高。过高的Spd和Spm可能对多胺降解产生影响，从而影响H2O2含量。在花后25、50和75d，ADC、SPDS、SPMS在‘锈酥’果皮中的表达量要高于‘砀山酥梨’，在花后50d表达量达到最高，这与前面测定的多胺含量在花后50d时，‘锈酥’果皮中的多胺含量要高于‘砀山酥梨’的结果相一致，由此可见，在花后50～100d多胺的变化，可能在果皮褐色形成过程中起了关键作用。

在‘砀山酥梨’与‘锈酥’外观表现差异的各个时期，两者果皮中的多胺含量、相关基因的表达也存在差异。因此推测，这些差异可能会对后续多胺分解中H2O2的含量产生影响，继而影响木质素含量，最后影响到‘锈酥’的果皮颜色形成产生。关于不同时期‘砀山酥梨’和‘锈酥’果皮中H2O2含量，与木质素含量的关系，正在进一步的试验研究之中。

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（编辑：宋亚珍）

Polyamines Content，Cloning and Expression of the Relevant Genes in Exocarp of‘Dangshansuli’Pear and Its Russet Fruit Mutant

SUN Hongli，WANG Ziteng，JIANG Xianghong，JIA Bing，LIU Li，YE Zhenfeng，HENG Wei，ZHU Liwu＊
（School of Horticulture，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China）

To investigate the mechanism of russet skin formation in pear（Pyrus bretschneideri Rehd.），we used the exocarp of the wild type‘Dangshansuli’and its mutant type‘Xiusu’pear with russet fruits at different days after full bloom（DAFB）as material in this experiment.The content of polyamine was determined by High Performance Liquid Chromatography（HPLC）.The key genes in polyamine biosynthesis were cloned by rapid amplification of cDNA ends（RACE），and their physicochemical properties were conducted by the protocol of Protparam website（http：／／web.expasy.org／protparam／）and the phylogenetic tree of putative proteins was constructed by MEGA5.0software.The relative expressions of ADC，SPDS and SPMSgenes at different stages were analyzed by using real－time quantitative reverse transcription－PCR（qRT－PCR）.The results showed that：（1）The putrescine contents in the exocarp of‘Dangshansuli’was significantly higher than that in‘Xiusu’except for 50and 150DAFB.At 75DAFB，the contents of spermidine and spermine in the exocarp of‘Xiusu’were higher than that in‘Dangshansuli’.（2）The genes of arginine decarboxylase（ADC），spermidine synthase（SPDS）and spermine synthase（SPMS）werecloned，and were submitted to the database of the National Center for Biotechnology Information（NCBI）with the accession number KM923903，KM923905and KM923906，respectively.The structure of putative proteins of ADC，SPDSand SPMSgene in pear was closer to that in apple.ADC and SPMS were all watersoluble by the prediction of their physicochemical properties.The SPDS was water－repellent by the prediction of their physicochemical properties.（3）The levels of relative expressions of ADC，SPDSand SPMSin the exocarp of‘Xiusu’were higher than that in‘Dangshansuli’at 50DAFB.It was postulated that the metabolism of polyamine and up－regulation of relevant genes may be associated with the formation of russet fruit of‘Xiusu’pear.

pear；russet fruit mutant；polyamine；gene clone；relative expression real－time PCR

Q945.6＋4；Q789

A

1000－4025（2015）08－1534－07

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.08.1534

2015－04－27；修改稿收到日期：2015－06－08

国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS－29－14）；国家自然科学基金（31101519）

孙虹丽（1989－），女，在读硕士研究生，主要从事果树分子生物学研究。E－mail：sunhongli1212＠163.com

＊通信作者：朱立武，教授，研究生导师，主要从事果树种质资源与遗传育种研究。E－mail：zhuliwu＠ahau.edu.cn