四物汤及其有效成分对大鼠肝脏主要药物代谢酶的影响

马增春，梁 淼，赵佳伟，2，王宇光，谭洪玲，梁乾德，汤响林，肖成荣，高 月

（1．军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850；2．安徽医科大学研究生学院，安徽合肥 230032）

四物汤及其有效成分对大鼠肝脏主要药物代谢酶的影响

马增春1，梁 淼1，赵佳伟1，2，王宇光1，谭洪玲1，梁乾德1，汤响林1，肖成荣1，高 月1

（1．军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850；2．安徽医科大学研究生学院，安徽合肥 230032）

中国图书分类号：R-332；R284．1；R289．5；R322.47；R345.99；R977.3

摘要：目的 研究四物汤及其有效成分对大鼠肝脏P450酶的影响，从药物代谢酶角度为四物汤的配伍规律提供实验依据。方法 大鼠口服灌胃四物汤10 g·kg－1·d－1及其有效成分果糖0.334 g·kg－1·d－1，阿魏酸0.002 g·kg－1·d－1，川芎嗪0.011 g·kg－1·d－1，芍药苷0.022 g·kg－1·d－1，连续给药1周后处死，用生理盐水灌流肝脏，制备肝微粒体，采用混合探针与肝微粒体体外孵育法考察四物汤及其有效成分对大鼠肝脏细胞色素P450酶的影响。利用实时定量聚合酶链式反应（Q-PCR）检测四物汤及其有效成分对大鼠肝脏P450 mRNA表达的影响，利用Western blot法检测四物汤及其有效成分对大鼠肝脏CYP2B1蛋白表达的影响。结果肝微粒体孵育结果显示，果糖对CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6酶活性具有抑制作用，阿魏酸对CYP2C9、CYP2B6酶活性具有抑制作用，川芎嗪对CYP1A2、CYP2C9、CYP2B6的酶活性具有抑制作用，芍药苷对CYP2D6、CYP2B6酶活性具有抑制作用。阿魏酸、果糖、芍药苷组对CYP2B1mRNA的表达具有抑制作用，与酶活性水平一致。4种单体成分对CYP2B1蛋白表达具有抑制作用。结论 阿魏酸、果糖、芍药苷组在CYP450酶活性、mRNA基因转录水平及蛋白表达水平对CYP2B1均有抑制作用。

关键词：四物汤；果糖；阿魏酸；川芎嗪；芍药苷；P450酶

网络出版时间：2015－8－10 14：37 网络出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．027．html

中药化学成分多种多样，当作为口服药物应用时，有些中药成分可直接吸收，而有些成分在代谢过程中活性降低或转变为无活性的物质，导致药理学上的失活，还有些成分可代谢转化为有药理活性的物质或活性增强而起作用，即活化过程。药物在胃肠道的代谢过程包括Ⅰ相反应和Ⅱ相反应，催化Ⅰ相反应的关键酶是细胞色素P450酶（CYP450）酶家族，作为机体对药物或外源物代谢的最主要功能蛋白，主要包括6种重要亚型：CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4［1－2］。中药强调合并用药，方剂以复方为主，因此中药配伍存在与P450酶有关的中药间相互作用，药物代谢酶是决定药物体内过程的关健因素，它们的抑制或诱导作用是药物联合应用时产生药动学相互作用的主要机制［3］。

四物汤（SiWu decoction，SWD）是补血名方，本室前期采用活性指导下的化学成分分析，发现了四物汤中促进造血功能的主要物质基础为多糖、阿魏酸、川芎嗪、芍药苷等，重构了基于四物汤有效成分的新组方，并且首次揭示了芍药苷具有促进造血的活性［4－8］，四物汤及其配伍对大鼠肝脏P450酶的研究结果表明，四物汤复方对大鼠肝脏CYP1A2具有诱导作用，对CYP2B6具有抑制作用［6］。本文根据4种有效成分在四物汤中的百分含量确定药物的给药剂量，探索四物汤中4种有效单体成分对CYP450酶活性影响，进一步在基因和蛋白水平进行确证，从药物代谢酶角度为四物汤配伍规律提供实验依据。

1　材料

1．1药品与试剂 四物汤由熟地、当归、白芍、川芎组成，全部购自同仁堂中药厂。果糖、阿魏酸、磷酸川芎嗪、芍药苷、咪达唑仑、甲苯磺丁脲、非那西丁、右美沙芬、扑热息痛、普萘洛尔均购于中国食品药品检定研究院。S-美芬妥因、1’-羟基咪达唑仑、4-羟基甲苯磺丁脲、4-羟基美芬妥因、右啡烷、安非他酮、4-羟基安非他酮均购自美国BD公司。还原型辅酶Ⅱ购自Roche公司。RNA提取试剂盒（Biomed公司），逆转录酶及Q-PCR扩增试剂（TransGen公司）。CYP1A2、CYP2C11、CYP2B1、CYP3A1及内参β-actin引物由英潍捷基合成。脱脂奶粉、硝酸纤维膜购自北京普利莱基因技术有限公司。CYP2B1抗体购自Santa Cruz公司（美国），发光剂购自Milli-pore Coporation，过硫酸胺购于Amersham Biosciences公司，TEMED购自生工生物工程（上海）有限公司，抗GADPH鼠单克隆抗体、山羊抗小鼠IgG、蛋白分

子量marker、组织蛋白抽提试剂盒、高效显影液试剂、30%丙烯酰胺－甲叉双丙烯酰胺、2×Sample Buffer、吐温-20均购自北京康为试剂公司。甲醇和乙腈为色谱纯，购自Fisher（美国），实验用水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1．2动物和分组 Wistar大鼠，在动物中心饲养3 d后，进行称重，随机分组。分为空白对照组、四物汤组、果糖组、阿魏酸组、川芎嗪组、芍药苷组，每组8只动物。

1．3仪器 Agilent 1290型超高效液相色谱仪（UHPLC，美国Agilent公司）；Agilent 6410B型三重四极杆串联质谱仪（美国Agilent公司）；Agilent ZORBAX EclipsePlus-C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm，美国Agilent公司）；RE52CS型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；电热恒温水浴锅（北京长安科学仪器厂）；SHB-ⅢA循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；Western blot转膜仪（Bio-Rad公司），电泳仪（Amersham公司），转移脱色摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；BS 223S型电子天平（塞多利斯科学仪器有限公司）；ABI Step One Plus荧光定量PCR仪（ABI公司）。

2　方法

2．1供试样品的制备 四物汤水煎液按《太平惠民和剂局方》规定的剂量称取组成，熟地15 g，当归10 g，白芍10 g，川芎6 g，共计41 g·d－1。四物汤复方组给药剂量根据实验室前期研究选取高剂量10 g ·kg－1·d－1，其他各组给药剂量按其在复方中百分含量进行换算（果糖3.34%，阿魏酸0.02%，川芎嗪0.11%，芍药苷0.22%），即果糖0.334 g·kg－1· d－1，阿魏酸0.002 g·kg－1·d－1，川芎嗪0.011 g· kg－1·d－1，芍药苷0.022 g·kg－1·d－1。连续灌胃给药7 d，禁食，制备肝微粒体。空白对照组给予等量的生理盐水。

2．2肝微粒体的制备 参考本室建立的方法提取肝微粒体［9］，大鼠脱臼处死，用生理盐水灌洗肝脏呈土黄色。将肝脏剪碎，按1∶4（W／V）加入TMS缓冲液，冰浴中匀浆后12 000×g，离心20 min，取上清液105 000×g离心60 min，弃上清，沉淀部分即微粒体。

2．3逆转录及实时定量聚合酶链式反应（Q-PCR）参考本室建立的方法进行Q-PCR检测［9］，大鼠处死后迅速取出肝脏，置于液氮中保存。按RNA提取试剂盒说明书提取肝脏总RNA。取总RNA 1μg进行反转录，条件为42℃30 min，85℃5 min。逆转录产物2 μL，加入2×TransStart Green qPCR Super- Mix 10 μL，Forward Primer 0.4 μL，Reverse Primer 0.4 μL，Passive Reference Dye 0.4 μL，加ddH2O补足反应体系至20 μL，荧光实时定量PCR的条件为94℃30 s，94℃5 s，60℃30 s，循环数为40。以β-actin作为内参基因，进行PCR扩增的实时定量分析，实验重复测定3次。特异性引物序列见Tab 1。

Tab 1 Sequences of primers used for Q-PCR

2．4液质联用检测条件 参考本室建立的方法进行［9］，以流动相A（含0.1%甲酸和5 mmol·L－1甲酸铵的纯水）和B（含0．1%甲酸的乙腈）梯度洗脱：30%B（0 min），95%B（1.5－3.5 min），30%B（3.6 min）；柱温25℃，流速为0.45 ml·min－1，运行时间4.5 min；进样体积10 μL。内标为普奈洛尔（100 μg ·L－1）。以ESI源正离子MRM方式检测，毛细管温度320℃，毛细管电压＋4000V，雾化电压25psi，干燥气流速10 L·min－1，其它质谱分析参数见Tab 2。

Tab 2 Parameters of mass detection

2．5肝微粒体孵育体系 参考本室建立的方法进行［10］，孵育体系包括肝微粒体（0.5 g·L－1），NAD-PH（1 mmol·L－1），CYP探针底物非那西丁（50 μmol·L－1）、甲苯磺丁脲（120 μmol·L－1）、美芬妥因（40 μmol·L－1）、右美沙芬（5 μmol·L－1）和咪达唑仑（5 μmol·L－1），K2HPO4／KH2PO4缓冲液（0.05 mol·L－1，pH＝7.4）补足体系至200 μL。37℃水浴预孵育5 min后加入同样预孵育5 min的NADPH启动反应，37℃水浴孵育30 min，加入200 μL的甲醇∶乙腈（1∶1）含有内标盐酸普奈洛尔100 mg·L－1的溶液终止反应，13 000×g、4℃离心10 min，取上清液进样，定量分析各底物的代谢产物

生成率，测得酶活性。

2．6大鼠肝脏CYP2B1蛋白表达的测定 称取0.1 g肝脏组织，加入1 mL组织蛋白抽提试剂，研磨后冰上孵育20 min，于10 000×g离心15 min提取蛋白，用BCA法测定蛋白含量。每组蛋白上样量为20 μg，120V恒压电泳。采用电转印仪转印3 h，用封闭液室温下封闭1 h，加入稀释后的CYP2B1一抗（1∶200）及GADPH抗体（1∶500）在室温下孵育2 h，用TBST在室温下脱色摇床洗3次。洗膜后加入适量稀释的二抗，于室温孵育1 h，用TBST室温脱色摇床洗3次，进行化学发光反应。

3　结果

3．1四物汤及其成分对大鼠肝脏CYP450酶活性的影响 利用Cocktail探针法对给药前后大鼠肝微粒体的酶活性变化进行检测，四物汤组及芍药苷组与对照组相比对CYP1A2酶活性具有上调作用（P ＜0.05），果糖和川芎组与对照组相比对CYP1A2酶活性具有下调作用（P＜0.05）。四物汤、果糖、阿魏酸、芍药苷以及川芎嗪组与对照组相比，对CYP2B6酶活性均具有抑制作用。果糖、阿魏酸、川芎嗪3组与对照组相比对CYP2C9酶活性具有下调作用，且果糖组下调作用较强。果糖组和芍药苷组与对照组相比对CYP2D6酶活性具有下调作用。见Tab 3。

Tab 3 Effect of SiWu decoction and its active components on activity of CYP450（μmol·min－1·g Pro）

Fig 1 Effect of SiWu decoction and its active components on cytochrome P450 mRNA in rats detected by Q-PCR

3．2四物汤及其成分对大鼠肝脏CYP450 mRNA的影响 选择CYP1A2、CYP2B1、CYP2C11、CYP3A1 4种CYP450酶亚型进行在mRNA检测，川芎嗪组与对照组相比对CYP1A2的mRNA具有下调趋势，四物汤组与对照组相比对CYP1A2的mR-NA是上调趋势，作用趋势与酶活性水平一致。阿魏酸、果糖及芍药苷3组与对照组相比对CYP2B1 的mRNA具有明显抑制作用（P＜0.05），果糖组与对照组相CYP2C11的mRNA具有明显抑制作用。见Fig 1。

3．3四物汤及其成分对大鼠肝脏CYP2B1蛋白的影响 利用Western blot检测了大鼠肝脏CYP2B1的蛋白表达，研究结果显示，与对照组相比，四物汤组、果糖、阿魏酸、芍药苷、川芎嗪4组对CYP2B1的蛋白表达均降低。见Fig 2。

Fig 2 Effect of SiWu decoction and its active components on CYP2B1 in rats liver detected by Western blot

4　讨论

细胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP450），属于血红素蛋白基因超家族，编码一系列的代谢酶系统，主要存在于肝微粒中，参与生物体内源性和外源性物质的生物转化，90%临床使用的药物要经过这些亚酶进行I相代谢。细胞色素P450酶作为人体重要的I相药物代谢酶系统，对药物代谢和药物之间的相互作用有着重要影响［11］。中药方剂以复方为主，含有多种中药，因此中药配伍存在与P450酶有关的中药间相互作用的机会可能更多，药物对P450酶产生影响，进一步受到影响的P450酶再作用于复方中其他成分，这就是基于P450酶的中药配伍研究的分子基础［12］。本文分析四物汤及其有效成分对P450酶活性、mRNA及蛋白表达水平的影响，发现基于药物代谢酶的中药相互作用模式，为临床用药提供理论依据。

检测四物汤中药效学物质果糖、阿魏酸、川芎嗪、芍药苷对CYP450酶活性、mRNA基因转录水平及蛋白表达水平的影响，结果发现果糖对CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6酶活性具有抑制作用，并且对CYP2C9、CYP2C19的调节作用要强于其他成分。阿魏酸对CYP2C9、CYP2B6酶活性具有抑制作用，对其他亚酶活性无影响。川芎嗪对CYP1A2、CYP2C9、CYP2B6的酶活性具有抑制作用。芍药苷对CYP1A2酶活性具有诱导作用，对CYP2D6、CYP2B6酶活性具有抑制作用。4种单体成分对CYP3A4酶活性和mRNA转录水平的影响并不是很明显。阿魏酸、果糖、芍药苷组对CYP2B1mRNA的表达具有抑制作用，与酶活性水平一致。进一步考察4种单体成分对CYP2B1在蛋白水平表达的影响，结果也具有抑制作用，提示单体成分对CYP2B1的调控有可能是作用于蛋白翻译环节，值得深入研究。

口服药物的吸收可能会受到肝细胞对其代谢的影响，细胞色素P450酶介导了许多药物之间的相互作用。从而改变了药物的药理－毒理效应，导致药效加强或副作用减轻，也可使某药效降低，或使某效应丧失，或出现毒性加重，或出现不应有的毒副作用。本文研究结果说明复方对CYP1A2具有诱导作用，对CYP2B6具有抑制作用，四物汤、四味单药以及两两配伍对CYP2B1的酶活性和mRNA表达有抑制作用［9］，4种单体成分对CYP2B1的酶活性和mRNA表达水平也有抑制作用，CYP2B1在四物汤配伍以及临床合理用药中的地位和作用值得进一步研究。

（致谢：本实验在军事医学科学院放射与辐射医学研究所药理毒理研究室完成。）

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Effects of Si-Wu Decoction and its active components on cytochrome P450 in rats

MA Zeng-chun1，LIANG Miao1，ZHAO Jia-wei1，2，WANG Yu-guang1，TAN Hong-ling1，LIANG Qian-de1，TANG Xiang-lin1，XIAO Cheng-rong1，GAO Yue1
（1．Beijing Institute of Radiation Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China；2．Graduate School of Anhui Medical University，Hefei 230032，China）

Abstract：Aim To study the influence of Si-Wu De-coction（SWD）and its active components on cyto-chrome P450 activity and mRNA expression in rats in order to provide an experimental basis for compatibility of SWD．Methods SWD and its active components were intragastrically administrated for seven days，the doses of SWD was 10 g·kg－1·d－1，the doses of fructose，ferulic acid，ligustrazine，peoniflorin were 0.334，0.002，0.011 and 0.022 g·kg－1·d－1，re-spectively．After administration for seven days，rats were executed，and liver microsomes were prepared．The effects of SWD and its active components on cyto-chrome P450 in rats were investigated by hybrid probe and liver microsomes incubation method．The level of mRNA expression in liver was detected by real-time quantitative polymerase chain reaction using specific target primers for CYP450 genes．The level of protein expression of CYP2B1 was detected by Western blot．Results Compared with the control group，fructose significantly decreased the activity of CYP1A2，CYP2B6，CYP2C9，CYP2D6；ferulic acid significantly decreased the activity of CYP2C9，CYP2B6；ligus-trazine significantly decreased the activity of CYP1A2，CYP2C9，CYP2B6；peoniflorin significantly decreased the activity of CYP2D6，CYP2B6；fructose，ferulic acid，peoniflorin inhibited the mRNA expression of CYP2B1；fructose，ferulic acid，ligustrazine and peon-iflorin also inhibit the protein expression of CYP2B1．Conclusion Fructose，ferulic acid，peoniflorin inhib-it the activity of CYP2B1，decrease the expression lev-els of mRNA and protein of CYP2B1．

Key words：SiWu Decoction；fructose；ferulic acid；ligustrazine；peoniflorin；CYP450

作者简介：马增春（1970－），男，博士，副研究员，研究方向：中药药理学，E-mail：mazchun＠139．com；高 月（1963－），女，博士，研究员，研究方向：中药药理学，通讯作者，E-mail：gaoyue＠bmi．ac．cn

基金项目：国家自然科学基金资助项目（No 81130067，81274127）

收稿日期：2015－05－13，修回日期：2015－06－25

文献标志码：A

文章编号：1001－1978（2015）09－1319－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．027