白藜芦醇对于小鼠败血症休克的保护作用及其作用机制的研究

陈红英，冀雅静，吴 丹，吴 瑶，蒋 维

（四川大学华西医院1．公共实验技术中心、2．分子医学研究中心，四川成都 610041）

白藜芦醇对于小鼠败血症休克的保护作用及其作用机制的研究

陈红英1，2，冀雅静2，吴 丹2，吴 瑶2，蒋 维2

（四川大学华西医院1．公共实验技术中心、2．分子医学研究中心，四川成都 610041）

中国图书分类号：R-332；R284.1；R329.24；R631.402.2

摘要：目的 从动物休克模型和细胞水平上研究白藜芦醇（resveratrol，Res）对败血症的调节作用及其分子药理学作用机制。方法 通过建立小鼠盲肠结扎穿孔诱导的败血症休克模型（CLP），研究白藜芦醇给药后的小鼠的存活率。然后利用体外培养的心肌细胞建立LPS损伤模型，采用反转录PCR（RT-PCR）、Real-time PCR检测细胞内源性TNF-α、SIRT1等的mRNA的表达水平，Western blot分析NF-κB重要亚基的蛋白表达水平。结果 与单纯休克模型组相比较，腹腔注射白藜芦醇（1和5 mg·kg－1·d－1）治疗明显增加败血症休克小鼠的存活率；白藜芦醇处理明显促进SIRT1、SIRT6和SIRT7的mRNA表达，抑制LPS诱导的NF-κB核转位。结论 适当剂量的白藜芦醇可能通过上调SIRT家族成员，并抑制NF-κB炎症反应通路，对败血症休克具有潜在的药理学保护作用。

关键词：败血症；LPS；白藜芦醇；SIRTs；NF-κB；TNF-α

网络出版时间：2015－8－10 14：37 网络出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．008．html

败血症是导致重病患者死亡的重要原因，近年来，临床败血症的发生率仍有继续上升的趋势［1］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰阴性菌的细胞壁糖脂成分，感染时释放的LPS作为一种潜在的信号分子，可以诱导系统性炎症反应，进而导致败血症性休克和死亡。败血症急性反应阶段的特征是发热，白细胞增多，血小板减少，血管通透性发生变化，代谢反应变化，还有器官功能性障碍。目前，探讨败血症的病理生理学基础，以期开发新的治疗方案是该疾病的研究热点和难点。

白藜芦醇（resveratrol，Res）是一种葡萄、梅子、花生和红酒中常见的具有抗氧化和抗炎症作用的天然多酚［2］。白藜芦醇被广泛用于消炎、抗肿瘤、抗衰老等不同方向的研究［3－4］，其抗炎作用可能与其降低脂质过氧化、提高MDA指数等有关。Bishayee等［5］研究发现，其在抗肝癌中具有明显的抗炎症作用，几乎可以抑制LPS引起的不良反应。最新研究认为，白藜芦醇是Sirtuin家族成员蛋白的激动剂，但白藜芦醇抗炎症的具体作用机制并未阐明，其抗感染性休克的研究亦未见报道。

哺乳动物Sirtuin基因家族，是酵母Sir2（silen-cing information regulator）基因的类似物，具有烟酰胺腺苷酸核酸（nicotimide adenosine dinucleotide，NAD）依赖的组蛋白／非组蛋白脱乙酰基酶活性及二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）核糖转移酶活性，与许多细胞功能密切相关。Sirtuin家族成员参与调节败血症过程中的免疫细胞或其他细胞的能量代谢过程，如SIRT1本身具有多样的非细胞核作用，这些作用直接参与炎症反应的调控。SIRT1增强作为能源替代途径的自噬过程、改变昼夜节律、提高内源性抗氧化物质的生成、促进线粒体的生物合成，这些都利于细胞产生内毒素耐受。SIRT2也表现出抗炎作用［6］。SIRT6也像SIRT1一样，可以和核因子κB（nuclear factor of kappa B，NF-κB）的主要亚基RelA／p65相结合并使其失活，也可以抑制急性炎症反应的THP-1细胞中的TNF-α表达，可能具有与SIRT1类似的抗炎作用。这些研究表明Sirtuin家族成员可能在多种细胞类型中通过不同的空间和时间调节过程将能量代谢和炎症联系起来［7］。

NF-κB蛋白是在固定免疫反应和炎症因子基因表达调控中发挥重要作用的转录因子。炎症刺激引起的NF-κB由细胞质向细胞核的转位级联反应，也是心肌细胞炎症过程所特有的。心肌细胞暴露于LPS、细胞因子、活性氧或缺血／再灌等因素的刺激下，激活IKK介导的IκBα的磷酸化，导致其自身降解，诱导p65／p50二聚体由胞质向胞核转位。

已有研究表明，白藜芦醇是一种Sirtuin家族成员的非特异性激动剂，可通过去乙酰化作用抑制NF-κB的转录活性［8］。本研究建立败血症动物休克模型和LPS诱导的H9c2细胞炎症模型，研究白藜芦醇的抗感染性休克作用，并进一步阐明白藜芦醇

通过调控Sirtuin家族成员与核转录因子NF-κB之间的相互作用，进而调控下游的炎症因子的转录，从而实现抗炎作用的机制，为感染性休克疾病的治疗提供新的理论基础及治疗策略。

1　材料与方法

1．1主要试剂 白藜芦醇（纯度99.5%）购于上海源叶生物科技有限公司，LPS购自Sigma公司，TR-Izol试剂购于Invitrogen公司，反转录酶M-MLV Re-verse Transcriptase购自Promega公司，反转录PCR 与Real-time PCR试剂盒购自TaKaRa，NF-κB一抗购自Cell Signaling Technology公司，Histone一抗购自Santa Cruz公司。

1．2实验动物 C57小鼠30只购自四川大学实验动物中心，8周龄，♂，置于符合标准温度空气等条件的培养室进行饲养。

1．3细胞培养 H9C2细胞株为国家重点实验室分子医学中心冻存。用含有10%胎牛血清，1×105U·L－1青霉素和1×105U·L－1的链霉素的DMEM培养基，在5%CO237℃的细胞培养箱内常规培养。0.25%胰酶消化传代。

1．4实验方法

1．4．1败血症休克小鼠模型的建立及处理 败血症休克模型的构建：用戊巴比妥钠麻醉剂（40 mg· kg－1）将动物浅度麻醉后，在小鼠腹部做1．5厘米的切口，寻得盲肠后在回盲瓣下方，用6-0丝线进行结扎，导致肠梗阻。然后，19号针对盲肠穿孔。将盲肠复位回腹腔，缝合伤口。注意，小鼠的手术顺序随机，以避免手术操作者操作时带来的误差。给药处理：将白藜芦醇溶于酒精中，分别得到1 g·L－1和5 g·L－1溶液；将8周龄大小的30只♂C57小鼠随机分为3组（每组10只），根据称量的小鼠体重计算给药剂量，以腹腔注射生理盐水的小鼠为对照组，白藜芦醇治疗组分为低剂量组（1 mg·kg－1·d－1）和高剂量组（5 mg·kg－1·d－1），小鼠术前2周接受每天1次的不同浓度的白藜芦醇腹腔注射，术后，继续按上述剂量每天给药1次。小鼠的状态观察和死亡时间统计：每日密切观察各组小鼠的病情发展。小鼠的存活率按小时计，误差控制在6 h以内。

1．4．2不同浓度的白藜芦醇与LPS刺激H9C2细胞中TNF-αmRNA表达变化实验的细胞分组与处理H9C2细胞用DMEM完全培养基传代培养，当细胞培养至对数期后用0.25%胰酶消化细胞后收集计数（台盼蓝染色法鉴定细胞活率≥95%），接种细胞至6孔板，每孔3×105个。于95%O2、5%CO2，37℃条件下培养24 h后，细胞贴壁。按实验要求细胞分为空白对照组；2 g·L－1白藜芦醇处理组；1 mg ·L－1LPS处理组，Res＋LPS组：根据Res浓度的不同（2 g·L－1和10 g·L－1）分为2个亚组，在每个亚组中，Res提前处理细胞24 h后，再与1 mg·L－1LPS共孵育3 h。收集细胞，提取RNA，然后检测TNF-α的mRNA表达水平，每实验组4个复孔，所有实验重复4次。

1．4．3白藜芦醇和LPS作用后H9C2细胞SIRT1、SIRT2、SIRT6和SIRT7的mRNA表达水平变化 实验的细胞分组与处理。细胞培养与传代方法同上，当细胞培养至对数期后用0．25%胰酶消化细胞后收集计数（台盼蓝染色法鉴定细胞活率≥95%），接种细胞至6孔板，每孔3×105个。于95%O2、5% CO2，37℃条件下培养24 h后，细胞贴壁。按实验要求细胞分为空白对照组；10 g·L－1白藜芦醇单独预处理24 h作为对照；剩余6组细胞分为3批，每批2组，分别为单独1 mg·L－1的LPS刺激的一组，和10 g·L－1白藜芦醇预处理24 h后再进行LPS刺激的一组。这3批细胞形成时间梯度，LPS处理时间依次为0.5、3、6 h。之后，收集细胞，提取RNA，逆转获得cDNA，用Real-time PCR检测SIRT1、SIRT2、SIRT6、SIRT7的mRNA表达水平的变化。每实验组4个复孔，所有实验重复4次。

1．4．4RT-PCR检测细胞内源性TNF-α的mRNA的表达 TRIzol试剂盒提取H9C2细胞总RNA，用逆转录酶和通用引物oligo（dT），以RNA为模板反转录合成cDNA的第一链。再以cDNA为模板，用目标引物与内标引物进行特异性的PCR扩增。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。TNF-α引物序列上游：5′-CAGGGACCAGAACCACAAG-3′，下游：5′-TG-GCAGCACTGAGGTAGAAG-3′，扩增产物：194 bp；内参GAPDH引物序列上游：5′-AGAAGGCTGGGGCT-CATTTG-3′，下游：5′-AGGGGCCATCCACGTCTTC-3′，扩增产物：258 bp；PCR条件为95℃5 min，95℃，30 s，54℃，30 s（内参58℃，30 s），72℃，30 s，72℃10 min，共30个循环，1.5%琼脂糖凝胶电泳PCR产物，溴化乙锭染色，在凝胶成像分析仪下成像，用Imagequant软件对条带进行灰度扫描分析，TNF-α基因的表达强度用TNF-α条带灰度与内标GAPDH条带灰度的比值表示。

1．4．5Real-time PCR检测细胞SIRT1、SIRT2、SIRT6和SIRT7的表达 提取H9C2细胞RNA，逆转录后参照说明书进行Real-time PCR实验，SIRT1的上游引物：5′-TTCAGAACCACCAAAGCG-3′，下游引物5′-CAGCAAGGCGAGC-ATAAA-3′；SIRT2的上

游引物：5′-TGGTGGGTCCTATTGTCG-3′，下游引物5′-CCTGCGGATGTGGAGATT-3′；SIRT6的上游引物：5′-GCCGTCTGGTCATTGTCA-3′，下游引物5′-AGCCTTGGGTGCTACTGG-3′；SIRT7的上游引物：5′-AGCGAAGCAGAGCCTAC-3′，下游引物5′-GCA-CAATGGTGTCCCGA-3′；PCR反应条件为：95℃，30 s，95℃，5 s，60℃，30 s，72℃，60 s，共40个循环。采集荧光信号，制作融解曲线。目的基因的相对表达率（RQ）采用△△Ct计算方法RQ＝2－△△Ct。

1．4．6Western blot检测NF-κB的表达 提取H9C2细胞核蛋白，BCA法分析定量蛋白含量，采用12.5%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，湿法转移至PVDF膜，5%牛血清白蛋白封闭，一抗（NF-κB，1∶1 000）孵育，4℃过夜，TBST洗涤后用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（1∶5 000）再孵育2 h，ECL法检测。用Bio-rad系统进行数据处理。所有实验重复4次。

1．4．7统计学方法 采用Prism5（GraphPad Soft-ware，SanDiego，CA，USA）软件进行分析。其中，白藜芦醇给药对休克小鼠生存率的影响数据采用Log rank（Mantel-Cox）test方法分析；其余数据以±s表示，3组及以上的均数比较采用单因素方差分析，两独立样本之间的两两比较则采用Student′s t-test。

2　结果

2．1适当剂量白藜芦醇腹腔注射后能明显改善败血症休克小鼠的存活率 Fig 1结果显示，与腹腔注射生理盐水的对照休克小鼠相比，腹腔分别注射1 与5 mg·kg－1·d－1白藜芦醇后，休克小鼠的存活率明显提高，且高剂量（5 mg·kg－1·d－1）白藜芦醇提高休克小鼠存活率的作用强于低剂量（1 mg· kg－1·d－1）处理组。表明白藜芦醇对败血症小鼠具有保护作用，且呈量效关系。

Fig 1 Hours after CLP surgery with different dosages of RES intraperitoneal injection

2．2白藜芦醇明显抑制LPS刺激的H9C2细胞的TNF-α mRNA表达 TNF-α作为炎症反应因子，其升高揭示了细胞的炎症反应状态，也表明LPS处理成功激活了炎症反应通路。我们采用RT-PCR方法检测TNF-α基因的相对表达水平，如Fig 2所示，2 g ·L－1白藜芦醇预处理细胞24 h后，与1 mg·L－1LPS共孵育3 h，与LPS单独处理3 h的对照细胞相比较，TNF-α的mRNA表达水平无明显变化。而10 g·L－1白藜芦醇预处理24 h的H9c2细胞，与1 mg ·L－1LPS共孵育3 h后，与LPS单独处理组相比较，明显抑制LPS刺激所增强的TNF-α的mRNA表达水平。结果表明，10 g·L－1白藜芦醇明显抑制LPS所诱导的炎症因子生成。

Fig 2 Effects of resveratrol on the expression of TNF-α mRNA

2．3白藜芦醇明显诱导H9c2细胞的SIRT1、SIRT2、SIRT6和SIRT7的mRNA表达 为了探讨白藜芦醇对小鼠败血症休克的保护机制，我们采用Real-time PCR检测H9C2细胞中SIRT1、SIRT2、SIRT6、SIRT7的基因表达。如Fig 3所示，与无任何刺激的对照细胞相比较，单纯白藜芦醇（10 g·L－1）刺激H9c2细胞24 h后，SIRT1的mRNA水平表现出明显增加，与夏洪娟等［9］文献报道一致。单纯LPS（1 mg·L－1）刺激0.5、3和6 h后，细胞的SIRT1 mRNA水平均明显高于空白对照细胞，但LPS作用6 h时出现明显的下降趋势。与单纯LPS 1 mg·L－1刺激的对照H9c2细胞相比较，白藜芦醇（10 g·L－1）与LPS共孵育0.5、3和6 h后均明显增加SIRT1的mRNA表达。Fig 4表明：与无任何刺激的对照细胞相比较，单纯白藜芦醇（10 g·L－1）刺激H9c2细胞24 h后，细胞SIRT2的mRNA水平明显增加。单纯LPS（1 mg·L－1）刺激0.5和3 h后，细胞的SIRT2 mRNA水平均明显高于空白对照细胞。与单纯LPS 1 mg·L－1刺激的对照H9c2细胞相比较，白藜芦醇（10 g·L－1）与LPS共孵育0.5、3

和6 h后均明显增加SIRT2的mRNA表达。如Fig 5所示，与无任何刺激的对照细胞相比较，单纯白藜芦醇（10 g·L－1）刺激H9c2细胞24 h后，细胞SIRT6的mRNA水平明显增加。单纯LPS（1 mg· L－1）刺激0.5 h后，细胞的SIRT6 mRNA水平均明显高于空白对照细胞。与单纯LPS 1 mg·L－1刺激的对照H9c2细胞相比较，白藜芦醇（10 g·L－1）与LPS共孵育6 h后明显增加SIRT6的mRNA表达。Fig 6表明：与无任何刺激的对照细胞相比较，单纯白藜芦醇（10 g·L－1）刺激H9c2细胞24 h后，细胞SIRT7的mRNA水平明显增加。与单纯LPS 1 mg· L－1刺激的对照H9c2细胞相比较，白藜芦醇（10 g· L－1）与LPS共孵育6 h后明显增加SIRT7的mRNA表达。

Fig 3 Res promotes the expression of SIRT1 increased

Fig 5 Res promotes the expression of SIRT6 increased

Fig 6 Res promotes the expression of SIRT7 increased

2．4白藜芦醇抑制LPS诱导的NF-κB核转位

由于通常条件下NF-κB蛋白含有p65亚基，故p65的蛋白水平反映了NF-κB的蛋白水平。用Western blot检测NF-κB的p65亚基的蛋白水平，结果如Fig 7所示，1 mg·L－1LPS刺激H9c2细胞0.5 h后，与无任何刺激的对照细胞相比较，细胞核内的p65蛋白水平明显增加。而10 g·L－1白藜芦醇预处理24 h后，再与LPS共孵育0．5 h后，细胞核内p65蛋白的水平明显低于单纯LPS刺激的细胞。结果提示白藜芦醇预处理及与LPS共孵育明显抑制LPS活化的NF-κB的核转位。而细胞核内NF-κB蛋白水平的下降，则进一步抑制NF-κB的转录调控活性，进而导致其调控的一些下游的炎症反应因子表达水平的下降。

Fig 7 Res inhibits LPS－induced nuclear translocation of NF-κB**P＜0.01 vs control；＃P＜0.05 vs LPS

3　讨论

CLP和LPS诱导动物休克模型被广泛应用于研究败血症过程中心血管和肺功能的病理生理学变化［10－12］。败血症疾病时，多器官、组织和细胞中的NF-κB活性增强，在该疾病的信号转导过程中起重要的作用。既往研究认为，各种刺激因素主要通过调节IκB的降解来调节NF-κB活性。但是越来越多的研究表明，NF-κB的活性调节还可以通过NF-κB蛋白的磷酸化和乙酰化等直接修饰作用实现。Chen等［13］认为NF-κB与HATs和HDACs之间存在相互作用，通过乙酰化调节基因转录。目前尚不清楚NF-κB与HATs和HDACs的具体作用方式，亦未阐明HATs或HDACs激动剂或抑制剂对感染性休克的药理学治疗效应。

Sirtuin是酵母NAD＋依赖性的组蛋白去乙酰基转移酶Sir2基因的真核生物类似物，该家族成员具有高度保守的催化结构域，可以通过对多种底物进行去乙酰化作用，从而在机体内参与一系列的生物学活动。这类酶主要位于细胞的核仁内，酶活性特别高，可被烟酰胺（nicotinamide）、sirtinol、splitomi-cin等所抑制，因此归为Ⅲ类HDAC。Sir2参与酵母的交配型基因、端粒和rDNA重复序列的沉默及调节细胞寿命，而Sirtuin维持细胞抗胁迫能力、基因组稳定性及参与能量代谢。Yeung等［14］观察到Sirt1可直接与NF-κB的主要亚基RelA／p65相作用，通过RelA／p65的310位赖氨酸的去乙酰化抑制其介导的基因转录，而Sirtuin激动剂Res亦促进染色质关联的Sirt1蛋白与cIAP-2启动子区域相互作用，减弱NF-κB信号，从而实现很强的细胞保护作用。最近，Kawahara等［15］观察到SIRT6与NF-κB 的RelA／p65亚单位相互作用，并在NF-κB靶基因启动子区域诱导组蛋白3的第9个赖氨酸位点去乙酰化，从而抑制NF-κB对基因转录的调控。目前尚不清楚Sirtuin家族与NF-κB之间的相互作用调节Res的抗感染性休克的作用及具体的机制。

本研究观察到白藜芦醇明显保护CLP诱导的败血症休克小鼠，提高其生存率。在LPS刺激的离体H9c2心肌细胞上，发现白藜芦醇有效激活Sirtuin 等III型HDAC的表达，同时抑制LPS诱导的NF-κB的核转位活动，并有效抑制LPS上调的炎症因子TNF-α等的表达，这与Shakibaei等［16－18］的报道一致。本研究结果提示白藜芦醇对败血症休克疾病潜在的药理学保护作用可能与活化Sirtuin、抑制NF-κB有关。为了阐明其具体的信号通路，Sirtuin和NF-κB之间的相互作用还值得我们进一步深入探讨。

综上所述，白藜芦醇对败血症休克及其心脏的损伤具有较强的治疗保护作用，提示多种Sirtuin家族成员如SIRT1、SIRT2、SIRT6和SIRT7的特异性激动剂可能对败血症休克及脓毒血症具有良好的治疗保护作用，但具体的分子药理学作用机制值得进一步研究。

（致谢：本研究课题主要在四川大学华西医院分子医学中心研究室与科研基地公共实验技术中心平台完成，感谢研究室与中心老师和同学的帮助与支持，尤其感谢蒋维老师的细心指导与大力支持，冀雅静同学的全力协助与参与！）

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Protective effects of resveratrol on sepsis and its involved mechanisms

CHEN Hong-ying1，2，JI Ya-jing2，WU Dan2，WU Yao2，JIANG Wei2
（1.Core Facility；2．Research Center for Molecular Medicine，West China Hospital，Sichuan University，Chengdu 610041，China）

Abstract：Aim To investigate the effect of resveratrol （Res）on septic mice and LPS-insulted H9c2 cells，as well as its involved mechanisms．Methods By use of a mouse cecal ligation and puncture-induced septic model（CLP），the survival of septic mice was evalua-ted after resveratrol treatments．H9c2 cells were insul-ted by LPS and then treated with resveratrol，the mR-NA expressions of TNF-α，SIRT1 and other class III HDAC members were detected using RT-PCR and real-time PCR，Finally，the protein levels of nuclear p65，an important subunit of NF-κB，were measured in H9c2 cells using Western blot assay，to reveal the effect of resveratrol on LPS-induced nuclear transloca- tion of NF-κB．Results Compared with the control septic animals，intraperitoneal injection of resveratrol （1 or 5 mg·kg－1·d－1）significantly increased the survival of septic mice．Furthermore，resveratrol signif-icantly increased mRNA expressions of SIRT1，SIRT2，SIRT6 and SIRT7 in LPS-insulted H9c2 cells．Res-veratrol also remarkably inhibited LPS-induced nuclear translocation of NF-κB．Conclusion An appropriate dose of resveratrol protects septic mouse hearts from the injury induced by LPS through the activation of SIRT family members and the inhibition of NF-κB pathway．

Key words：sepsis；LPS；resveratrol；SIRTs；NF-κB；TNF-α

作者简介：陈红英（1978－），女，硕士生，研究方向：心血管药理学，E-mail：chy30＠126．com；蒋 维（1972－），男，博士，博士生导师，研究方向：心血管药理学，通讯作者，Tel：028-85164103，E-mail：wcumsjw ＠scu．edu．cn

基金项目：国家自然科学基金面上项目（No 31071001，31271226）

收稿日期：2015－04－29，修回日期：2015－06－02

文献标志码：A

文章编号：1001－1978（2015）09－1216－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．008