升麻素在大鼠体内的药代动力学研究

王晓钰，江小燕，于 曦，刘海亮，王 燕，陶 羽，洪 敏

（南京中医药大学药学院，科技部国家规范化中药药理实验室，江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏南京 210023）

升麻素在大鼠体内的药代动力学研究

王晓钰，江小燕，于 曦，刘海亮，王 燕，陶 羽，洪 敏

（南京中医药大学药学院，科技部国家规范化中药药理实验室，江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏南京 210023）

中国图书分类号：R-332；R282.71；R284.1；R969.1

摘要：目的 建立升麻素（cimifugin）血药浓度的高效液相色谱（HPLC）测定方法，研究其在大鼠体内的药代动力学特点。方法 大鼠灌胃给予升麻素，取各时间点大鼠血浆，采用乙腈蛋白沉淀法，运用内标法进行HPLC检测，并用DAS2．1软件计算药代动力学参数。结果 升麻素血药浓度的回归方程为Y＝0.187X－0.0236，R2＝0.9982，其中升麻素在1～70 mg·L－1范围内线性关系良好，药时曲线符合二室开放模型，主要药代动力学参数Tmax、Cmax、T1／2α、T1／2z、Vd、AUC（0－t）、AUC（0－∞）分别为80 min、10.359 mg·L－1、47.597 min、93.131 min、2.179 L·kg－1、1946.085 mg·L－1·min、2138.57 mg·L－1·min。结论建立了升麻素血药浓度方法，该方法专属性强，灵敏度高，可用于该药的体内定量分析。升麻素在大鼠体内被快速吸收达最大浓度，并发挥作用。

关键词：升麻素；HPLC；大鼠；药代动力学；方法学；过敏性皮炎

网络出版时间：2015－9－14 14：53 网络出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．046．html

升麻素（cimifugin）是防风色原酮类成分，具有抗炎解表、祛风益气之功效。由防风、黄芪、白术三味药组成的复方玉屏风散，通常用于表虚自汗，反复呼吸道感染及过敏性哮喘、鼻炎、皮炎等过敏性疾病［1］。本实验室前期研究表明玉屏风散可明显抑制小鼠过敏性炎症［2］，对玉屏风散含药血清进行了HPLC-MS分析，推断出10个成分中，其中4个来源于防风，升麻素即是被检测的色原酮成分之一，且在血清中含量较高［3］，提示升麻素是其主要入血成分之一。药代动力学的研究对阐明中药药效物质基础、揭示其科学内涵，新药创制、剂型改进以及方剂组分配伍机制的研究均有着非常重要的作用［4］，因此为了进一步了解升麻素在体内的吸收代谢规律，本实验建立了升麻素血药浓度的HPLC检测方法。考察了升麻素在大鼠体内的药代动力学特点，为升麻素的药物研发及药理作用和机制研究提供依据。

1　材料与方法

1．1仪器 LC-20AT高效液相色谱系统，SPD-M20A二极管阵列检测器，SIL-20A全自动进样器，日本岛津；MTN-2000W氮气浓缩仪，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；MS3涡旋震荡混匀仪，德国IKA；Microfuge16离心机，美国BECKMAN。

1．2主要试剂 升麻素，购于上海永恒生物科技有限公司，批号：20120511；对照品升麻素（批号：111710-200501）、葛根素（批号：110752-200912，96%）购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯（江苏汉邦科技有限公司）；水为纯水；乙腈为色谱纯（山东禹王实业有限公司）；其他试剂均为分析纯。

1．3实验动物 SD大鼠72只，♀♂各半。购于南京医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（苏）2013－0005。

1．4标准品溶液的制备 取1 mg升麻素对照品，精密称定，加甲醇定容至1 mL，用于配制标准曲线。取1 g·L－1升麻素对照品，配成1～70 mg·L－1浓度范围内的标准品。

1．5色谱条件 色谱柱：Dikma platisil ODS 5U C18柱（25 cm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A），纯水（B），梯度洗脱：0－10 min，20∶80（V／V）－40∶60（V／V），10－30 min，55∶45（V／V）；检测波长：286 nm；流速：1 ml·min－1；进样量：10 μL。

1．6动物处理 将72只SD大鼠随机分为12组，每组6只，除空白组外，其余按小鼠50 mg·kg－1给药剂量换算成大鼠为34 mg·kg－1，给药体积10 ml ·kg－1。灌胃前禁食12 h，自由饮水，各组灌胃升麻素后分别在12、20、40 min、1、2、3、4.5、6、8、12、24 h时间点眼眶静脉丛取血0.5 mL，置于1.5 mL离心管中（加肝素抗凝），以3 500 r·min－1，离心10 min，取上层血浆备用。

1．7血浆样品处理 在100 μL血浆中加入300 μL乙腈，100 μL甲醇和30 μL内标溶液（葛根素50 mg·L－1），涡旋3 min，离心（10 400 r·min－1）5 min，取上清，37℃氮气吹干，100 μL甲醇复溶，离心3 min，进样10 μL，进行HPLC检测。

1．8标准曲线制备 取70、42、29.4、21、10、6、3、1 mg·L－1甲醇溶解的对照品溶液100 μL。加入到100 μL空白血浆中，再加入300 μL乙腈，30 μL内标溶液，涡旋3 min，离心（10 400 r·min－1）5 min，取上清，37℃氮气吹干，100 μL甲醇复溶，离心3 min，进样10 μL。以对照品峰面积A1／内标峰面积A2为纵坐标，浓度C（mg·L－1）为横坐标，绘制标准曲线。

2　结果

2．1专属性 分别取空白血浆、含升麻素与葛根素（内标）的空白血浆、受试大鼠含药血浆，按“1．7”项下方法处理，液相色谱中进样，获得相应色谱图，专属性实验结果显示葛根素的保留时间是13.595 min，升麻素的保留时间是22．145 min，色谱分离良好，不受内源性杂质峰干扰，见Fig 1。

Fig 1 HPLC chromatograms of cimifugin in plasma

2．2稳定性 按“1．7”项下方法处理制备70 mg·

L－1（高）、29．4 mg·L－1（中）、3 mg·L－1（低）3个浓度的升麻素样品，分别于－40℃与常温下反复冻融3次，每次各30 min，每个浓度平行操作3份。结果显示RSD值均小于0.5%，样品反复冻融3次仍稳定，见Tab 1。

Tab 1 Stability result of cimifugin in plasma of rats（n＝3）

2．3精密度 按“1．7”项下方法处理，制备70 mg ·L－1（高）、29.4 mg·L－1（中）、3 mg·L－1（低）3个浓度的升麻素样品，每个浓度平行操作5份，根据标准曲线计算日内和日间精密度，结果显示RSD均符合要求，见Tab 2。

Tab 2 Intra-and inter-precision result of cimifugin in plasma of rats（n＝5）

2．4回收率 按“1．7”项下方法处理，制备70 mg ·L－1（高）、29.4 mg·L－1（中）、3 mg·L－1（低）3个浓度的升麻素样品，每个浓度平行操作5份，记录升麻素处理前后峰面积，根据标准曲线方程，得出血浆中升麻素的浓度，计算回收率，回收率／%＝处理后／处理前×100%。结果显示回收率、RSD均符合要求，见Tab 3。

Tab 3 Recovery rate of cimifugin in plasma of rats（n＝5）

2．5标准曲线 按“1．8”项下方法分析结果，计算出相应的回归方程：A1／A2＝0.187C－0.0236，R2＝0.9982，其中升麻素在1～70 mg·L－1范围内线性关系良好，见Fig 2。

2．6药代动力学参数 大鼠灌胃给予34 mg· kg－1升麻素后，各时间点测得平均血药浓度见Fig 3。用DAS 2.1软件拟合，升麻素药代动力学符合二室开放模型，大鼠体内的相关药动学参数见Tab 4。

Fig 2 Calibration curve of cimifugin

Fig 3 Mean plasma concentration-time curves of cimifugin（n＝6）

Tab 4 Main pharmacokinetic parameters of cimifugin（n＝6）

3　讨论

过敏性疾病（allergic dieases）是由机体对抗原所产生的异常免疫反应引发的疾病，在过去几十年中发病率明显上升，严重影响人们的生活质量。目前对该类疾病的治疗方案多以西药为主，但不良反应较多。本课题组研究的玉屏风散可用于防治过敏性疾病，防风作为其单味药，发挥药效的物质基础主要为升麻素苷、升麻素等色原酮成分，而升麻素苷在体内极易转化为其苷元升麻素［5］。升麻素在大鼠体内的药代动力学过程尚不明确。

本实验建立了升麻素血药浓度测定方法［6］，该方法专属性强，灵敏度高，研究结果显示，升麻素单次给药在80 min左右即达到了最大浓度，其最大浓度为10.359 mg·L－1，半衰期为47.597 min，12 h左右已检测不到血清含量。这些数据表明，升麻素可以吸收入血，其入血后的量可以检测到，升麻素单次给药后被迅速吸收达最大浓度，并发挥作用。前期研究表明，升麻素对Th2型ACD小鼠模型有抑制作用［7－8］，本实验对其药代动力学的研究为后期升麻素在过敏性疾病致敏和激发不同阶段发挥作用的研究提供基础，也为新药研发提供了理论支持。

（致谢：本实验在南京中医药大学药学院，科技部国家规范化中药药理实验室，江苏省中药药效与安全性评价重点实验室完成。在此感谢实验室为我提供的优越实验条件与平台，同时感谢导师和同学对我的指导和帮助以及中国药理学通报编辑老师对本文提出的宝贵意见。）

参考文献：

［1］ 陈向涛，李 俊．玉屏风散的药理学研究进展［J］．安徽医药，2003，7（4）：241－3．

［1］ Chen X T，Li J．The pharmacology research progress of Yupingfeng San［J］．Anhui Med Pharm J，2003，7（4）：241－3．

［2］ 邵建华，洪 敏，牛 艳，等．玉屏风散抑制小鼠Th2型变应性接触性皮炎［J］．中国实验方剂学杂志，2011，17（14）：173－5．

［2］ Shao J H，Hong M，Niu Y，et al．Yupingfeng San Inhibits Th2 Cell-mediated Allergic Contact Dermatitis in Mice［J］．Chin J Exp Tradit Med Formul，2011，17（14）：173－5．

［3］ 洪 敏，周红华，王 亮，等．玉屏风散乙酸乙酯萃取物抑制迟发型超敏反应效应及成分分析［J］．中国实验方剂学杂志，2010，16（1）：71－3．

［3］ Hong M，Zhou H H，Wang L，et al．Yupingfeng San ethyl acetate extrets inhibit delayed-type hypersensitivity effect and composition analysis［J］．Chin J Exp Tradit Med Formul，2010，16（1）：71－3．

［4］ 吕 莉，孙慧君，韩国柱，等．中药药代动力学的研究进展［J］．药学学报，2013，48（6）：824－33．

［4］ Lyu L，Sun H J，Han G Z，et al．Research progresses of pharmaco-kinetics of traditional Chinese medicine［J］．Acta Pharmacol Sin，2013，48（6）：824－33．

［5］ 赵晓莉，刘 玲，狄留庆，等．毛蕊异黄酮葡萄糖苷及其苷元大鼠体内药代动力学特征的影响研究［J］．中国中药杂志，2014，39（23）：4669－73．

［5］ Zhao X L，Liu L，Di L Q，et al．Studies on effects of calycosin-7-O-β-D-glucoside on prim-O-glucosylcimifugin and cimifugin in vi-vo pharmacokinetics［J］．China J Chin Mat Med，2014，39（23）：4669－73．

［6］ 甘 萍，霍仕霞，白 鹏，等．类叶升麻苷在大鼠体内的药代动力学及组织分布研究［J］．中国药理学通报，2014，30（3）：417 －20．

［6］ Gan P，Huo S X，Bai P，et al．Pharmacokinetics and tissue distri-bution of acteoside in rats［J］．Chin Pharmacol Bull，2014，30 （3）：417－20．

［7］ 江小燕，王慧珠，桂黎黎，等．升麻素通过调节2型细胞因子抑制过敏性炎症［J］．中国药理与临床，2014，30（2）：28－9．

［7］ Jiang X Y，Wang H Z，Gui L L，et al．Cimifugin inhibits allergic contact dermatitis by regulating type 2 cytokines［J］．Pharmacol Clin Chin Mater Med，2014，30（2）：28－9．

［8］ 桂黎黎，洪 敏，王慧珠，等．基于Th2型过敏性接触性炎症的胸腺机制淋巴细胞生成素产生小鼠模型的建立［J］．中国药理学通报，2013，29（10）：1473－4．

［8］ Gui L L，Hong M，Wang H Z，et al．A mouse model of TSLP pro-duction based on Th2 cell-mediated allergic inflammation［J］．Chin Pharmacol Bull，2013，29（10）：1473－4．

Pharmacokinetic study on cimifugin in rats

WANG Xiao-yu，JIANG Xiao-yan，YU Xi，LIU Hai-liang，WANG Yan，TAO Yu，HONG Min
（School of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，National Standard Laboratory of Pharmacology for Chinese Materia Medica，Jiangsu Key Laboratory for Pharmacology and Safety Evaluation of Chinese Materia Medica，Nanjing 210023，China）

Abstract：Aim To establish a HPLC method for de-termining cimifugin in rat plasma and investigate the pharmacokinetic characteristics of cimifugin in rats．Methods The plasma concentration of cimifugin was detected by HPLC in acetonitrile protein precipitation method after intragastric administration of cimifugin．The pharmacokinetic parameters were calculated by the procedure of DAS 2．1．Results The regression equa-tion of cimifugin in rats plasma was Y＝0.187X－0.0236（R2＝0.998 2），which shows a good linear re-lation at 1－70 mg·L－1．The concentration-time curves conformed to two-compartment model．The main pharmacokinetic parameters of Tmax，Cmax，T1／2α，T1／2z，Vd，AUC（0－t）and AUC（0－∞）were 80 min，10.359 mg ·L－1，93.131 min，2.179 L·kg－1，1946.085 mg ·L－1·min，2138.57 mg·L－1·min，respectively．Conclusions We established a HPLC method to de-termine the concentration of cimifugin in plasma．The method is so highly specified and sensitive that it can be used in quantitative analysis in vivo on cimifugin．Cimifugin can be rapidly absorbed，reach the highest concentration and produce effect．

Key words：cimifugin；HPLC；rat；pharmacokinet-ics；methodology；allergic dermatitis

作者简介：王晓钰（1990－），女，硕士生，研究方向：免疫药理学，E-mail：wangxiaoyu0504＠126．com；洪 敏（1972－），女，博士，教授，研究员，博士生导师，研究方向：中药免疫药理学，通讯作者，E-mail：hongmin72＠126．com

基金项目：国家自然科学基金资助项目（No 81473395，81373549，81073121）；江苏省自然科学基金资助项目（No BK20141466）；江苏省儿童呼吸疾病（中医药）重点实验室资助项目（JKLPRD201405）；江苏高校优势学科建设工程资助项目；江苏省‘青蓝工程’资助

收稿日期：2015－05－20，修回日期：2015－07－23

文献标志码：A

文章编号：1001－1978（2015）10－1443－04

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．023