吴茱萸碱调控人结肠癌HCT-116细胞中JAK2／STAT3信号通路的机制研究

赵绿翠，廖 科，李科琼，李 静

（重庆医科大学1．干细胞与组织工程研究室、2．药物高校工程研究中心，重庆 400016；3．成都市肿瘤医院，四川成都 610041）

吴茱萸碱调控人结肠癌HCT-116细胞中JAK2／STAT3信号通路的机制研究

赵绿翠1，2，廖 科3，李科琼1，李 静1

（重庆医科大学1．干细胞与组织工程研究室、2．药物高校工程研究中心，重庆 400016；3．成都市肿瘤医院，四川成都 610041）

中国图书分类号：R329．25；R735.350.22；R979.1

摘要：目的 探讨吴茱萸碱（evodiamine，EVO）对人结肠癌HCT-116细胞中JAK2／STAT3信号通路的影响。方法

EVO诱导人结肠癌HCT-116细胞2、4、6 h后，Hoechst法检测细胞核凋亡的形态学改变；6 μmol·L－1的EVO作用于HCT-116细胞2、4和6 h，不同浓度的AG490作用于HCT-116细胞48 h，6 μmol·L－1的EVO和50 μmol·L－1的AG490分别诱导HCT-116细胞以及两药联合诱导HCT-116细胞6 h后，运用蛋白质印迹法检测各组细胞中JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3的蛋白表达量。结果 镜下观察EVO诱导后的细胞核浓缩聚集，染色质边缘化，并出现染色质碎裂成块，形成凋亡小体等形态学改变。Western blot结果显示：EVO可以明显下调HCT-116细胞内p-STAT3的表达；AG490可以抑制JAK2／STAT3信号通路的激活；EVO对JAK2／STAT3信号通路中p-STAT3蛋白的表达抑制效果较AG490更明显，且两药联合应用后抑制效果进一步增强。结论 EVO对人结肠癌HCT-116细胞的抗肿瘤活性有可能是通过抑制JAK2／STAT3信号通路的激活来发挥的。

关键词：吴茱萸碱；HCT-116细胞；JAK2／STAT3信号通路；p-STAT3；AG490；抗肿瘤活性

网络出版时间：2015－9－14 14：53 网络出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．028．html

近年来结肠癌的致死率在全球所有癌症致死率中排名第4位，每年因结肠癌的死亡人数约为69.4万［1］。结肠癌目前的治疗除手术治疗外，主要采用化疗和放疗的联合治疗方式，由于化疗药物的毒副作用较大，因此用中药治疗结肠癌，提高患者的生活质量成为目前国内研究的热点。有研究表明，吴茱萸碱对多种肿瘤细胞，如人乳腺癌MDA-MB-231细胞［2］、人肝癌HepG2细胞［3］、鼠黑色素瘤B16-F10细胞［4］等具有明显的肿瘤抑制作用，但其对人结肠癌HCT-116细胞的抗肿瘤活性鲜有报道。STAT3在肿瘤细胞中呈高表达，JAK2／STAT3信号通路的过度活化与多种肿瘤的恶性转化有密切关系。吴茱萸碱对人结肠癌细胞HCT-116中JAK2／STAT3信号通路的药理作用尚不清楚。本研究观察了吴茱萸碱对人结肠癌HCT-116细胞的杀伤作用，并探讨其抗肿瘤活性的可能机制。

1　材料与方法

1．1主要试剂与仪器 吴茱萸碱（evodiamine，EVO）标准品购自中国南京泽朗医药公司（批号：ZL20131015，HPLC检测纯度大于0．98）；AG490购自美国Tocris生物科学公司；IL-6购自美国Sigma公司；BCA蛋白定量检测试剂盒和Hoechst染色试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；兔抗人JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3抗体、β-actin抗体和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG均购于美国Cell Sig-naling Technology公司。M450酶标测定仪，垂直电泳仪，电转仪，化学发光成像系统购自美国Bio-Rad公司；CO2恒温细胞培养箱购自美国Forma scientific公司；高速台式离心机购自美国Sigma公司。

1．2细胞培养和药物诱导 HCT-116结肠癌细胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基于CO2恒温细胞培养孵箱常规培养，待细胞处于对数生长期时，将贴壁细胞消化并离心5 min，离心转速为1 000 r·min－1，随后将细胞团重悬制成单细胞悬液，以5 ×108·L－1的密度接种于10 cm的培养皿中，置于培养箱。当细胞生长融合度至60%～70%，用不含血清的培养基处理24 h后，加入药物诱导。常规细胞培养组为对照组；合适浓度的EVO或AG490诱导HCT-116细胞组作为药物诱导组。

1．3Hoechst法检测细胞核的变化 取处于生长对数期的人结肠癌HCT-116细胞，以2×108·L－1的密度接种于无菌盖玻片上，并置于6孔板中，待细

胞贴壁后加入6 μmol·L－1的EVO，分别诱导2，4，6 h作为药物诱导组，并设置不加药的细胞组为对照组，每组平行接种3个复孔。弃掉旧培养液，每孔加入1 mL的4%多聚甲醛，固定30 min。去除固定液，用PBS洗涤2遍，每次3 min。吸尽液体，加入1 mL的Hoechst 33258染色液，染色8 min。吸去液体，稍微晾干。用PBS洗2遍，每次3 min，洗涤时手轻轻晃动6孔板。于避光的条件下，滴1～2滴50%甘油于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免有气泡产生。于荧光显微镜下观察，激发波长为350 nm左右，发射波长460 nm左右。

1．4Western blot法检测细胞中JAK2、p-JAK2，STAT3和p-STAT3等蛋白表达量的变化

1．4．1EVO对细胞中目的蛋白表达量的影响 取长势良好的HCT-116细胞，以5×108·L－1的密度接种于10 cm的培养皿中。待细胞处于对数生长期时，根据我们前期研究所筛选出的药物浓度［5］，将实验组别设置为：对照组、实验组（6 μmol·L－1的EVO分别诱导HCT-116细胞2、4和6 h）。收集各组细胞，用细胞裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定各组蛋白含量并配平，使各组蛋白终浓度一致。每个点样孔加40 μg蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳分离目的蛋白。根据目的蛋白分子大小：JAK2（130 ku）、p-JAK2（125 ku）、STAT3（86 ku）和p-STAT3 （92 ku）剪切适当大小的凝胶。将凝胶上的蛋白转至PVDF膜，用5%的BSA封闭膜上的蛋白结合位点2 h。采用兔抗人JAK2（1∶1 000）、p-JAK2（1∶1 000）、STAT3（1∶1 000）、p-STAT3（1∶1 000）；兔抗人内参β-Actin（1∶1 000），4℃孵育过夜。用TBST溶液漂洗3次，每次10 min。分别加入辣根过氧化物标记的山羊抗兔IgG（1∶1 000）常温孵育1.5 h。用TBST溶液漂洗后用显色剂ECL显色、曝光。运用图像分析软件Quantity One测定条带的灰度值，用对照组及其余各组目的条带灰度值分别和内参条带的灰度值的比值表示蛋白表达水平，统计分析后作图。

1．4．2AG490对细胞中目的蛋白表达量的影响实验设置组别为：对照组、实验组（0.5、5和50 μmol ·L－1AG490组）。AG490作用48 h后，用25 μg· L－1的IL-6处理15 min并收集各组细胞，Western blot法检测各组细胞中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3等蛋白表达量的变化。

1．4．3EVO和AG490对细胞中目的蛋白表达抑制率的比较 实验设置5个组别：阴性对照组、对照组、50 μmol·L－1AG490＋IL-6诱导组、6.0 μmol· L－1EVO＋IL-6诱导组和（50 μmol·L－1AG490＋6.0 μmol·L－1EVO）＋IL-6诱导组。在收集细胞之前除阴性对照组外，其余各组均用25 μg·L－1的IL-6处理15 min。Western blot法检测各组细胞中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3等蛋白表达量的变化。

1．5统计学分析 采用SPSS 16．0统计软件对所得数据进行分析，计量资料以±s表示。两样本均数间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。

2　结果

2．1EVO诱导HCT-116细胞的凋亡 如Fig 1所示，6.0 μmol·L－1的EVO分别作用于HCT-116细胞2、4、6 h后，可见细胞核的染色质浓缩聚集，边缘化，并出现染色质碎裂成块，形成凋亡小体，且这种变化呈时间依赖性。这表明，EVO对人结肠癌HCT-116细胞有诱导凋亡的作用。

Fig 1 Effect of EVO on morphology of HCT-116 cell nucleus by fluorescence microscopy

2．2EVO对HCT-116细胞中目的蛋白的影响如Fig 2（A，B）所示，Western blot检测结果显示，6.0 μmol·L－1的EVO分别作用于HCT-116细胞2、4、6 h后，p-STAT3蛋白的表达量呈下降的趋势，与对照组之间的对比差异有显著性（P＜0.05）。这一结果表明，吴茱萸碱对HCT-116细胞的体外抗肿瘤活性，可能是通过抑制JAK2／STAT3信号通路的激活而发挥作用。

2．3AG490对HCT-116细胞中目的蛋白的影响如Fig 3（A，B）所示，Western blot检测结果显示，

不同浓度JAK2的特异性抑制剂AG490（0.5、5、50 μmol·L－1）分别作用于HCT-116细胞48 h后，与对照组比较，JAK2、P-STAT3等目的蛋白的表达量均表现出下降的趋势，与对照组比较差异均有显著性（P＜0.05），结果提示：50 μmol·L－1的AG490可以明显阻滞JAK2／STAT3信号通路的激活，因此后续试验中选用50 μmol·L－1的AG490作为诱导HCT-116细胞的最佳药物浓度。

Fig 2 Cells treated with 6 μmol·L－1EVO for various lengths of time，and then analyzed for the level changes of JAK2，p-JAK2，STAT3 and p-STA3 by Western blot

2．4EVO和AG490对HCT-116细胞中目的蛋白抑制作用的比较 如Fig 4（A，B），Western blot检测结果显示，阴性对照组和加入IL-6组比较，IL-6仅对目的蛋白中p-STAT3的活化作用差异有统计学意义，因此可以排除IL-6的加入对AG490和EVO分别对HCT-116细胞中各目的蛋白作用的干扰。用浓度为6.0 μmol·L－1的EVO和50 μmol·L－1的AG490诱导HCT-116细胞6 h后，与对照组比较，EVO诱导组较AG490诱导组对p-STAT3蛋白的下调作用更明显；且两药联合诱导后，表现出协同作用，对HCT-116细胞中p-STAT3的表达抑制作用较单独用药更明显。

Fig 3 HCT-116 cells induced by AG490 and then stimulated with 25 μg·L－1IL-6 for 15 min

3　讨论

STAT3在肿瘤细胞中呈高表达，被认为是癌基因，且STAT3的活化及过度表达与细胞的恶化有关［6－8］。JAK2／STAT3信号通路的过度活化与乳腺癌、结肠癌、神经胶质瘤和皮肤癌等［9－10］多种肿瘤的发生和进展密切相关。在JAK／STAT信号激活的过程中，IL-6首先与IL-6受体（IL-6Rα）结合，继而激活胞质内JAK，然后STAT在JAK的催化下发生磷酸化，程序性激活JAK2／STAT3信号通路，从而参与调控肿瘤的侵袭和迁移［11－12］。因此，本研究中用IL-6激活JAK2／STAT3信号通路进行实验。我们发现，有研究表明［13］，STAT3的早期磷酸化发生在药物诱导6 h。因此，我们分别采取EVO处理HCT-116细胞2、4、6 h作为实验所用的时间梯度。结果表明，EVO可以明显减少HCT-116细胞中p-STAT3的表达。

AG490作为JAK2／STAT3信号通路的特异性抑制剂可以阻断该信号通路的激活。Western blot结

果显示：经AG490处理后，HCT-116细胞中JAK2／STAT3信号通路的激活被阻断。另与AG490诱导组相比，EVO诱导组对HCT-116细胞中的p-STAT3的表达抑制作用更为明显，并呈时间依懒性；与AG490诱导组和EVO单独诱导组相比，EVO和AG490联合诱导组可进一步抑制HCT-116细胞中JAK2／STAT3信号通路中p-STAT3蛋白的表达。

Fig 4 HCT-116 cells treated with 50 μmol·L－1AG490，6 μmol· L－1EVO or 50 μmol·L－1AG490 combined with 6 μmol·L－1EVO for 2，4，6 h and then stimulated with 25 μg·L－1IL-6 for 15 min

综上所述，较低浓度的吴茱萸碱短时间内即可诱导人结肠癌HCT-116细胞的凋亡。吴茱萸碱对人结肠癌HCT-116细胞有明显的抗肿瘤活性，其作用机制可能与吴茱萸碱明显抑制HCT-116细胞中JAK2／STAT3信号通路的激活有关，因而吴茱萸碱可以作为一种潜在的STAT3磷酸化的有效抑制剂，同时为开发一种低毒高效的抗肿瘤药物或药物前体提供了一定的参考价值。

（致谢：本实验在重庆医科大学干细胞与组织胚胎研究工程室完成。衷心感谢组胚平台的所有老师及同学对我的支持与帮助！尤其感谢李静老师在课题经费方面对该研究作出的支持与贡献；感谢廖科同学给予我实验技术方面的指导；感谢李科琼在实验数据统计分析方面给予我很大的帮助，正是有了你们的帮助才使我顺利完成该研究。）

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Modulatory effect of Evodiamine on JAK2／STAT3 signal pathway in HCT-116 cells

ZHAO Lyu-cui1，LIAO Ke2，LI Ke-qiong3，LI Jing3
（1．Dept of Stem Cell and Tissue Engineering，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2．Drug Engineering Research Center of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；3．Chengdu Tumor Hospital，Chengdu 610041，China）

Abstract：Aim To investigate the inhibitory effect of Evodiamine on JAK2／STAT3 signal pathway in human colorectal cancer cell line HCT-116．Methods Cells were cultured with 6．0 μmol·L－1Evodiamine for 2，4 and 6 h，respectively．Cell nuclear morphology was detected by Hoechst staining and protein expression levels of JAK2，p-JAK2，STAT3 and p-STAT3 were examined by Western blot．Cells were treated with dif-ferent concentrations of AG490 for 48 h to select proper working concentration and cells treated with 6 μmol· L－1EVO and 50 μmol·L－1AG490 to compare the modulatory effect of EVO with AG490 on JAK2／STAT3 signal pathway．Results Hoechst staining revealed that Evodiamine could induce cells apoptosis，chroma- tin condensation gathered and typical apoptotic mor-phological changes in a time-dependent manner；West-ern Blot suggested that EVO could inhibit p-STAT3 significantly．After treatment with AG490，JAK2／STAT3 signal pathway was inactivated，the inhibitory effect of EVO on p-STAT3 was stronger than that of AG490，while EVO combined with AG490 could fur-ther inhibit the expression of p-STAT3 significantly．Conclusions The anticancer effect of Evodiamine is mainly mediated by the modulation of JAK2／STAT3 signal pathway in HCT-116 cells．

Key words：Evodiamine（EVO）；HCT-116 cells；JAK2／STAT3 signal pathway；p-STAT3；AG490；an-ticancer effect

作者简介：赵绿翠（1986－），女，硕士生，研究方向：药物的抗肿瘤活性及其药理学作用机制，E-mail：lvcuizhao＠sina．com；李 静（1973－），女，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：药物抗肿瘤，通讯作者，Tel：023-68485614，E-mail：li-jingyangyang＠126．com

基金项目：国家自然科学基金资助项目（No 31271368）；重庆市渝中区科技计划项目（No 20140123）

收稿日期：2015－06－04，修回日期：2015－07－27

文献标志码：A

文章编号：1001－1978（2015）10－1394－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．014