超声波辅助提取刺梨中SOD的工艺研究

王振伟，许 镭

（黄河水利职业技术学院，河南 开封 475004）

超声波辅助提取刺梨中SOD的工艺研究

王振伟，许 镭

（黄河水利职业技术学院，河南 开封 475004）

采用正交试验优化提取条件，研究超声波辅助提取刺梨中超氧化物歧化酶的工艺。结果表明：磷酸钠缓冲溶液是SOD的有效提取剂，刺梨SOD的最合适pH值范围为7.6～8.0。超声提取最佳工艺条件为：超声功率200W，固液比1∶10，超声时间6 s，时间间隔2 s，超声次数30次。按照该工艺提取刺梨SOD活性为546.9U／g。

超声波；刺梨；超氧化物歧化酶；提取条件；工艺研究

0 引言

刺梨是蔷薇科蔷薇属落叶灌木，又名缫丝花、文先果、送春归，多分布于贵州、云南等西南省份［1］，近些年在河南也栽植成功。刺梨中含有特别高的超氧化物歧化酶（SOD），还含有丰富的维生素及微量元素。其中，SOD是国际公认的具有抗衰老、防癌作用的活性物质［2-4］。

随着SOD药理作用研究的深入，其提取也越来越受到人们的重视。目前，常用的提取方法有浸提法、索氏提取法、双水相体系提取法、乙醇-氯仿法及超声波辅助提取法［5-6］等。其中，用超声波破碎细胞提取植物中的活性物质费时少、得率高，因此被广泛应用［7］。本研究以冷冻的刺梨果实为原料，采用超声波破碎细胞法提取SOD，并采用正交试验设计优化提取工艺条件，为实现刺梨产品从低端到高附加值产品开发提供理论参考。

1 实验设施和方法

1.1 试剂与仪器

实验所用刺梨购自河南开封金维康野生植物开发有限公司，所用试剂包括：邻苯三酚、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、磷酸、盐酸、乙醇（95%）、丙酮等。所有试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

实验所用仪器包括：TU-1810型紫外-可见分光光度计 （北京普析通用仪器有限责任公司生产），JY99-IIDN型超声波细胞破碎仪 （宁波新芝生物科技有限公司生产），HC-3018R型冷冻离心机 （科大创新股份有限公司中佳分公司生产），AB204-L型电子天平（梅特勒-托利多集团生产）。

1.2 实验方法

1.2.1 SOD的提取及活力测定

称量10.0 g刺梨冷冻样品，用榨汁机破碎打浆，加入一定体积的提取剂，振荡混匀后，超声波作用一定时间，然后，用高速冷冻离心机于6 000 r／min离心5min，收集上清液即为SOD粗提液。采用邻苯三酚自氧化法测定SOD活性［8］。

1.2.2 不同提取试剂提取效果比较

新鲜刺梨样品破碎打浆后，按照固液比（刺梨质量／磷酸缓冲液体积）1∶10分别加入蒸馏水（pH值为7.0）、0.05mol／L的磷酸钾缓冲液 （pH值为7.8）、0.05 mol／L的磷酸钠缓冲液（pH值为7.8）和0.05mol／L的氯化钠溶液，超声波功率300W，超声提取5min，用高速冷冻离心机于6 000 r／min离心5min，收集上清液，并测定其活性。

1.2.3 超声波提取单因素试验设计

通过初步的实验探索，选取固液比、超声波功率（W）、超声时间（s）、超声次数及提取剂pH值等因素为考察对象。在初始条件下，考察不同超声波功率（100、200、300、400、500W）、不同超声波工作时间（3、6、9、12、15 s，每个工作时间次数20次，间隔2 s）、不同固液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）、不同超声次数（10、20、30、40、50次，超声时间6 s）和磷酸缓冲液pH值 （分别为7.0、7.2、7.4、7.6、7.8和8.0）对SOD活性的影响。

1.2.4 正交试验

在单因素试验的基础上，选择对SOD活性影响较大的因素和水平，采用正交试验对SOD的提取工艺进行优化，得到较高的SOD活性。

2 试验结果与分析

2.1 不同提取液对SOD活性的影响

分别以蒸馏水、0.05mol／L的磷酸钾缓冲液（pH值为 7.8）、0.05 mol／L的磷酸钠缓冲液 （pH值为7.8）和0.05mol／L的氯化钠溶液为提取剂，提取粗酶液的活性，结果如图1所示。

图1 提取剂对SOD活性的影响Fig.1 Effect of extractant to SOD active

由图1可以看出，以磷酸钠缓冲溶液为提取剂提取的SOD活性最高，其次是磷酸钾缓冲溶液。这主要是因为，SOD作为蛋白质更易溶于磷酸缓冲溶液中，提取的蛋白质含量较高，活性也较高。蒸馏水和氯化钠溶液提取的粗酶液由于含有的蛋白质含量较少，致使测得的酶活性较低。因此，选取磷酸钠缓冲液作为提取剂为宜。

2.2 超声波提取单因素试验

2.2.1 超声波功率对SOD活性的影响

称量10.0 g刺梨冷冻样品，用榨汁机破碎打浆，然后，按固液比1∶10的比例加入0.05mol／L的磷酸钠缓冲溶液（pH值为7.8）。最后，按照超声时间6 s、超声次数20次、时间间隔2 s的方式，分别调整超声功率为100、200、300、400、500W进行超声提取。不同超声功率对SOD活性的影响结果如图2所示。

由图2可以看出，随着超声波功率的增加，粗酶提取液的活性逐渐提高，当超声波功率达到300W时，SOD活性达到最大。之后，活性随功率的增加呈下降趋势。由此可见，在超声提取过程中，功率是一个重要的因素，功率越大，刺梨细胞破壁效果越好，溶出物越多。但是，一些物质容易受到损坏。SOD是蛋白质，其活性受其结构的影响。在高超声功率的情况下，SOD结构可能会发生一定的变化，从而影响酶的活性。综合考虑，采用不高于300W的超声功率应提取比较合适。

2.2.2 超声时间对SOD活性的影响

将10.0 g冷冻刺梨样品用榨汁机破碎打浆后，按固液比1∶10的比例加入0.05mol／L的磷酸钠缓冲溶液 （pH值为7.8），然后按超声功率200W，超声时间分别设为3、6、9、12、15 s，超声次数20次，时间间隔2 s的方式进行超声波提取，其结果如图3所示。

图3 超声时间对SOD活性的影响Fig.3 Effects of ultrasonic wave time to SOD active

由图3可以看出，超声时间对于植物细胞的破碎也是一个很重要的因素。随着超声工作总时间的延长，蛋白质溶出越多，粗酶提取液中SOD浓度越大，因而SOD活性逐渐上升。但当超声时间超过9 s后，SOD活性开始降低，超声波效果下降。这可能是因为超声波是一种高能波，超声作用时间累积也会破坏溶出物中的一些活性物质。而SOD是酶类物质，可能也受到一些影响，从而造成活性降低。

2.2.3 固液比对SOD活性的影响

将10.0 g冷冻刺梨样品用榨汁机破碎打浆后，分别按固液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25的比例加入0.05mol／L的磷酸钠缓冲溶液 （pH值为7.8），然后按超声功率200W、超声时间6s、次数20次、时间间隔2 s的方式进行超声波提取，其结果如图4所示。

从图4可知，当固液比为1∶5时，缓冲溶液加入量比较少，超声作用时，溶液比较黏稠，超声效果受到影响，蛋白析出受到影响，粗酶液酶活较低。当固液比达到1∶10时，缓冲溶液增加，浓度得当，超声波作用时，促进蛋白质析出，SOD活性最高。当固液比继续增加时，酶活略有下降。这说明，提取液中，蛋白质浓度变小对后期浓缩纯化将增加困难。因此，料液比1∶10左右较为合适。

图4 固液比对SOD活性的影响Fig.4 Effects of solid-to-liquid ratio to SOD active

2.2.4 超声次数对SOD活性的影响

称量10.0 g刺梨冷冻样品，用榨汁机破碎打浆后，按固液比1∶10的比例加入0.05mol／L的磷酸钠缓冲溶液（pH值为7.8），然后按照超声功率200W、超声时间6 s、分别超声10、20、30、40、50次、时间间隔2 s的方式进行超声提取，结果如图5所示。

图5 超声次数对SOD活性的影响Fig.5 Effects of ultrasonic wave times to SOD active

由图5可以看出，超声次数越多，粗酶提取液的SOD活性越大。这是由于，当超声次数增多时，细胞壁被破坏的可能性越大，蛋白质溶出越多，SOD含量越高，活性越大。当超声次数达到30次以上，SOD活性增长平缓。从能效和SOD活性保持方面考虑，不是超声次数越多越好，因此，选择30次较为合适。2.2.5 提取剂的pH值对SOD活性的影响

称量10.0 g刺梨冷冻样品，用榨汁机破碎打浆后，按固液比1∶10的比例分别加入0.05mol／L的磷酸钠缓冲溶液（pH值分别为7.0、7.2、7.4、7.6、7.8和8.0），然后按超声功率200W、超声时间6 s、超声次数20次、时间间隔2 s的方式进行超声波提取，结果如图6所示。

图6 提取剂pH值对SOD活性的影响Fig.6 Effects of extractant pH values to SOD active

由图6可知，pH值对SOD的活性影响较大，当提取剂pH值为7.8时，粗酶液的SOD活性最大。每种酶都有最适pH值，刺梨SOD的最适pH值范围为7.6～8.0。

2.3 正交试验

根据单因素试验结果，超声功率、超声时间、固液比和超声次数等多个因素对SOD的活性均有影响。选择L9（34）正交试验，以确定超声提取刺梨SOD的最佳工艺。其因素水平表如表1所示，正交试验结果如表2所示。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors level of orthogonal test

由表2可知，各种因素对刺梨中SOD提取效果的影响主次顺序为：A＞C＞D＞B，即超声功率＞固液比＞超声次数＞超声时间。刺梨中SOD的超声提取最佳工艺为：超声功率200W，固液比1∶10，超声时间6 s，超声次数30次。按照该工艺提取，刺梨SOD活性为546.9U／g。

3 结语

每种酶都有其最适的pH值，研究结果表明，刺梨中SOD最适的pH值为7.6～8.0。用pH值为7.8的磷酸钠缓冲溶液可以对刺梨中SOD进行有效的提取。超声波能够在最大限度保存酶活的情况下提高其提取率。正交试验结果表明，影响刺梨中SOD活性提取的因素主次顺序为：超声功率＞固液比＞超声次数＞超声时间。得出的超声提取最佳工艺为：超声功率200W，固液比1∶10，超声时间6 s，超声次数30次，超声间隔2 s。超声辅助提取技术不仅可以解决传统提取技术发展瓶颈，而且可以大大缩短生产周期，提高产品得率。实验通过超声波辅助对刺梨中SOD进行提取工艺研究，为进一步开发研究刺梨中SOD提供了部分理论依据。

表2 L9（34）正交试验表Table 2 L9（34）orthogonal test

［1］王振伟，胡晓冰，王恺，等.微波辅助提取刺梨中总黄酮的工艺参数优化光谱实验室，2012，29（3）：1527-1530.

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［6］郭兴凤，张娟娟，马宇翔，等.响应面法优化中性蛋白酶提取米渣中蛋白质的研究［J］.河南工业大学学报：自然科学版，2008，29（6）：13-17.

［7］李祖明，霍笑靓，高丽萍，等.酶法辅助超声波法提取类球红细菌SOD工艺研究［J］.沈阳农业大学学报，2014，45（1）：47-51.

［8］GB／T 5009.171-2003，保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定［S］.

[责任编辑 杨明庆]

O644

B

1008-486X（2015）01-0046-04

2014-07-10

2013年院级科学技术基金项目：刺梨中SOD的提取纯化技术及制剂工艺研究（2013KXJS011）。

王振伟（1980-），男，河南沈丘，讲师，硕士，从事食品加工专业的教学与研究工作，研究方向：食品生物技术。