负载抗原的DC疫苗联合多种T细胞治疗非小细胞肺癌的近期疗效与不良反应

王作志，解尚云，刘庆云，魏长宏，卞晓山

250014济南，武警山东总队医院：1.肿瘤科，2.生物诊疗中心

负载抗原的DC疫苗联合多种T细胞治疗非小细胞肺癌的近期疗效与不良反应

王作志1，解尚云2，刘庆云1，魏长宏1，卞晓山1

250014济南，武警山东总队医院：1.肿瘤科，2.生物诊疗中心

非小细胞肺癌治疗方法有手术、放射治疗(放疗)、化学药物治疗(化疗)三种方式，对机体免疫均有不同程度损伤，而免疫治疗通过调节机体免疫功能，能够发挥防止肿瘤复发和转移的作用[1]。本研究于2011-10至2014-02采用负载抗原的DC疫苗联合多种T细胞治疗非小细胞肺癌，旨在通过诱导各种功能完善的T细胞，为患者建立全新、健全的免疫体系，并评估其近期疗效与不良反应。

1对象与方法

1.1对象对非小细胞肺癌24例进行负载抗原的DC疫苗联合CIK、γδΤ、NK细胞免疫治疗。其中男16例，女8例，年龄41～83岁，平均57.5岁；ECOG评分为0～3分，其中0分1例，1分11例，2分8例，3分4例；肺腺癌14例，肺鳞癌7例，混合型肺癌3例；术后病理分期为T2～T4，其中Ⅱ期10例，Ⅲ期10例，Ⅳ期4例。本研究经我院伦理委员会审查通过，患者本人或其法定代理人知情并同意接受免疫治疗。

24例中，年龄较大不能接受手术和放、化疗的患者有4例；多发转移不能接受手术，仅接受放、化疗单项或者两项治疗的患者有3例；病情较重不能接受或者不愿接受手术和放、化疗的患者有3例；其余都接受手术治疗，并且根据病情接受放、化疗单项或者两项治疗。所有接受放、化疗患者在治疗结束2周后进行免疫治疗。

1.2主要试剂GM-CSF、IL-4、TNF-a、IL-1α为美国peprothch 产品，CD3mAb为R&D公司产品，IL-2为北京双鹭生物制药有限公司产品，异戊烯焦磷(isopentenylpgrophosphate，IPP)购自sigma公司。DC和NK流式：FITC标记CD83、CD86，APC标记CD3，PE标记CD56 BD Accuri C6流式细胞仪测定。CIK流式：PerCP标记CD3，APC标记CD56，BD Accuri C6流式细胞仪测定。

1.3各种细胞扩增方法的建立经血细胞分离机(COM.TEC，Fresenius Kabi生产)机采后分离出患者自体外周血单个核细胞(PBMC)，获得80 ml PBMC。

1.3.1DC疫苗制备取适量PBMC加入含invitrogen-15的培养瓶中，在37 ℃、5% CO2培养箱温浴2 h，吸出悬浮细胞。贴壁细胞加入invitrogen-15(含GM-CSF 1000 U/ml， IL-4 20 ng/ml)，置37 ℃、5% CO2培养。培养第3天补液，第5天加入自体肺癌细胞裂解物蛋白[2](未进行手术治疗的患者用相应的细胞株细胞制备的蛋白替代)致敏DC。第6天加入肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，第8天收集成熟DC疫苗回输或冻存备用。

1.3.2CIK细胞扩增方法取适量PBMC，加入含IFN-γ(1000 U/ml)GT-T551培养液，于37 ℃,5% CO2培养。细胞培养24 h后加入终浓度为100 ng/ml 的小鼠抗人CD3单抗、1000 U/ml IL-2，以及100 U/ml IL-1α 继续培养。观察细胞生长情况，每隔2～3 d补液(含IL-2)，培养12～15 d收集[3]。

1.3.3γδΤ细胞扩增方法取适量PBMC加入终浓度为10 ng/ml IPP、1000 U/ml IL-2 AIM-V培养液，于37 ℃，5% CO2培养。每日观察细胞生长情况，每隔2～3 d补液(含IL-2)，培养10～14 d收集。

1.3.4NK细胞扩增方法取适量PBMC，用NKGM培养体系培养，培养15～20 d收集。

1.4治疗方案

1.4.1DC细胞静脉制剂的制备将洗涤后的(1.2～1.5)×107DC细胞用100 ml生理盐水重悬，静脉回输；DC细胞皮内注射制剂的制备：将洗涤后的(1.2～1.5)×107DC重悬在2 ml生理盐水中，在两侧免疫部位分12点皮内注射，每侧2 ml，免疫部位选择双侧腹股沟内侧[4]。γδΤ、CIK及NK细胞静脉制剂的制备：γδΤ、CIK和NK细胞离心洗涤后，将上述细胞(5～8)×109用100 ml生理盐水重悬，静脉回输。

1.4.2输注方法各种细胞经细菌、真菌和支原体检测及培养，确保回输安全。检测合格后制备成制剂。患者接受一疗程的治疗，采血当天记为第0天，DC细胞第8天静脉输注、皮内注射各1次，第15、22天皮内注射各1次；γδΤ细胞第10、11、12天静脉输注各1次；CIK细胞第13、14、15天静脉输注各1次；NK细胞第16、17天静脉输注各1次[5]。所有患者治疗后即进入随访。

1.5评价指标(1)有可评价病灶的患者临床疗效评定，按照卫生部1988年颁布实体瘤客观疗效评定标准进行。对于没有可评价病灶的患者影像学检查发现疾病复发或转移则为PD。(2)通过检测24例患者在治疗前与治疗后2个月外周血CD3+、CD4+、CD56+变化，来评定治疗前后的免疫功能的变化。

2结果

2.1DC、NK和CIK细胞免疫表型培养的DC高表达成熟DC的特异性表面标志CD83，同时也高表达CD86等共刺激分子(图1AB)，NK细胞表面高表达CD16+、CD56+(图1C)，CIK细胞表面高表达CD3+、CD56+(图1D)。

图1　DC、NK和CIK细胞免疫表型检测

2.2近期临床疗效随访时间为治疗后5～18个月，中位时间10个月。22例有可评价病灶的患者中9例PR，11例SD，2例PD；2例没有可评价病灶的患者中1例PD，1例未见疾病进展。其中1例PR患者情况如下：未接受手术和放、化疗，行一疗程免疫治疗后，复查发现双肺多个病灶消退或体积减少(图2)。

图2　非小细胞肺癌患者CT扫描

2.3免疫学反应结果治疗2个月后，CD3+、CD4+和CD56+均比治疗前升高(P<0.01)，CD8+轻微升高(P<0.05)，表明免疫功能在治疗之后有了改善(表1)。

表1　治疗前、后T淋巴细胞亚群免疫指标变化　(n=24；±s；%)

2.4不良反应治疗过程中2例轻微发热，1例畏寒，均自行消退，没有发现严重的不良反应。

3讨论

细胞免疫治疗是除手术、放疗、化疗以外的第四种肿瘤治疗模式，过继性免疫治疗是肿瘤治疗的重要手段。有关恶性肿瘤患者CD4+T细胞亚群的改变情况报道不一，但多数研究显示，CD4+T细胞亚群在恶性肿瘤患者中表现为减少[6-8]。本研究通过流式细胞检测法分析非小细胞肺癌患者免疫治疗后的外周血CD3+、CD4+和CD56+比例，结果显示该比例较治疗前明显升高，表明治疗后患者免疫功能提高，有利于减缓非小细胞肺癌的转移和复发。

本研究的策略是，24例中有手术条件者先进行手术治疗，以降低肿瘤负荷，再根据患者情况进行放、化疗，之后进行生物治疗。结果表明，经过负载抗原的DC疫苗联合CIK、γδΤ、NK细胞免疫治疗后，在22例有可评价病灶的患者中9例达到PR，11例为SD，2例为PD；2例没有可评价病灶的患者中1例PD，1例未见疾病进展。患者临床症状得以改善，生活质量有所提高，治疗过程中没有严重的不可耐受的不良反应出现，这说明了负载抗原的DC疫苗联合多种T细胞治疗是安全的。但治疗过程中2例轻微的发热，1例畏寒，可能是免疫治疗后大量的细胞因子释放引起的。分析免疫功能提高的原因，可能是传统的放、化疗与DC疫苗治疗之间有协同作用，放、化疗之后对肿瘤免疫性具有激发效应，且没有损害免疫效应细胞的功能，这为开发新的化学免疫治疗提供了有力的理论依据。

目前，国内外对于肿瘤患者体内T细胞的研究结果不尽一致[8]，表明T细胞在肿瘤免疫中的作用和地位应该从细胞数量、细胞功能等多方面综合考虑分析。笔者今后将从多方面、多角度对非小细胞肺癌患者T细胞的免疫功能进行研究，为肿瘤免疫治疗提供新的线索和依据。

【参考文献】

[1]Schmidt-Wolf G D，Negrin R S，Schmidt-Wolf I G. Activated T cells and cytokine-induced CD3+CD56+killer cells[J].Ann Hematol，1997，74(2)：51- 56.

[2]Jung H K, Yoom L, Yong-Soo B,etal. Phase Ⅰ/Ⅱ study of immunotherapy using autologous tumor Lysate-pulsed dendritic cells in patients with meatastatic renal cell carcinoma[J].Clin Immunol, 2007, 12(5)：257-267.

[3]Hwan Mook Kim, Jaeseung Lim, Song-Kyu Park,etal. Antitumor activity of cytokine-induced killer cell against human lung cancer[J]. Int Immunopharmacol,2007, 24(5)：1802-1807.

[4]Holtl L，Zelle-Rieser C，Gander H，etal. Immunotherapy of metastatic renal cell carcinoma with tumor lysate-pulsedautologous dendritic cells[J]. Clin Cancer Res，2002，8(11)：3369- 3376.

[5]Morse M A，Coleman R E，Akabani G，etal. Migration of human dendritic cells after injection in patients with metastaticmalignancies[J]. Cancer Res，1999，59(1)：56-58.

[6]Adwani S H,Kutty P M,Copal R,etal. Immunity in oesophageal carcinomal[J].J Surg Oncol，1983，24(4)：268.

[7]Olsen G N,Cangemi J D.Bronchoalveolar layage and the immunologe of primary lung cancer[J].Chest，1985，87(5)：677-683.

[8]Mitropoulos D,Alamanis C,Deliveliotts C,etal.T-lymphocyte subsets in the periphcral blood of patients with renal cell carcinoma[J].Arta Urol Belg，1995，63(3) ：21-25.

(2014-10-15收稿2014-12-05修回)

(责任编辑尤伟杰)

【摘要】目的评估采用负载抗原的DC疫苗联合多种细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、γδ受体的T细胞(γδT)和自然杀伤细胞(NK)治疗非小细胞肺癌的近期疗效与不良反应。方法经机采后分离出单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，体外经相应的细胞因子诱导产生DC、γδT、CIK和NK细胞。所有患者接受一疗程治疗，即静脉输注或皮内注射4次DC疫苗，静脉输注γδT、CIK各3次，静脉输注NK细胞2次，共12次治疗。通过影像学检查及外周血T淋巴细胞亚群改变评估疗效和免疫学反应。结果22例有可评价病灶的患者中9例部分缓解(PR)，11例疾病稳定(SD)，2例进展(PD)；2例没有可评价病灶中1例PD，1例未见疾病进展。与治疗前比较，治疗2个月后CD3+、CD4+、CD56+有较大升高，差异有统计学意义(P<0.01)。结论负载抗原的DC疫苗联合多种T细胞治疗非小细胞肺癌有一定的近期临床疗效，能诱导出特异的抗非小细胞肺癌免疫反应。

【关键词】非小细胞肺癌；树突细胞；自然杀伤细胞；肿瘤裂解物

【中国图书分类号】R734.2

Efficacy and adverse reactions of antigen-loaded dendritic cell vaccine in combination with various T cells on nonsmall-cell lung cancer

WANG Zuozhi1, XIE Shangyun2, LIU Qingyun1, WEI Changhong1, and BIAN Xiaoshan1. 1. Department of Oncology, 2. Biotherapy Center, Shandong Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Jinan 250014 ,China

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the clinical efficacy and adverse reaction of antigen-loaded dendritic cells(DC)vaccine in combination with cytokine-induced killer cells(CIK), gamma delta receptors of T cells(γδT)and natural killer cells(NK)on 24 patients with lung cancer. MethodsMononuclear cells isolated by blood apheresis were induced into productions of DC, γδT, CIK and NK cells by corresponding cytokines in vitro. All patients received a course of treatment including intravenous infusion and intradermal injection of DC vaccine for four times, intravenous infusion of γδT, CIK each 3 times and intravenous infusion of NK cells twice, a total of 12 times. Clinical and immunologic responses were evaluated by imaging examination，T lymphocytes subset changes, respectively. Results22 patients were enrolled in this study. During 5-24 months follow-up(median，10 months)，partial remission(PR)in 9 cases，stability of disease(SD) in 11 cases，and progression of disease(PD) in 2 cases was identified with measurable diseases progress. After 2 months treatment，the levels of CD3+、CD4+、CD56+increased very significantly(P<0.001). No severe adverse events were observed except 2 patients with mild fever and 1 patient had muscular soreness. ConclusionsAntigen-pulsed DCs in combination with various T cells shows short-term efficacy on lung cancer through inducing specific antitumor immunity.

【Key words】nonsmall-cell lung cancer；dendritic cells；NK；tumor cell lysate

作者简介：王作志，本科学历，副主任医师,E-mail：wangzuozhi9110@163.com