盐酸莫西沙星片健康人体生物等效性研究

郭　喆,朱　哲,史小四,强烈应

100036,武警北京总队第二医院药剂科

盐酸莫西沙星片健康人体生物等效性研究

郭喆,朱哲,史小四,强烈应

100036,武警北京总队第二医院药剂科

盐酸莫西沙星是第四代喹诺酮类药物的首推代表,由拜耳公司研制，商品名为“拜复乐”，于1999年在德国首次上市，同年12月在美国上市[1]，2002年及2004年在我国上市，分别包括片剂和输液剂两类。莫西沙星的化学结构是在八位碳原子引入了甲氧基因，使其增加了药物对细菌的结合能力和细胞膜的穿透力，而且抗菌的效应强大而持久[2]。以其抗菌谱广、杀菌力强、体内药物浓度高、血浆消除半衰期长、疗效好、不良反应少、耐药性低等优点，得到临床广泛应用，在国内一上市即表现出良好的发展态势，2011年全国医院用药费用已超十亿元。盐酸莫西沙星片是“拜复乐”的仿制药物，为探索其与原研产品的生物等效性，经伦理委员会批准，开展本研究。

1材料与方法

1.1试验设计以健康受试者为对象，采取随机、阳性对照、开放、自身三交叉的临床试验研究。

1.2试验用药受试制剂A(TA)：盐酸莫西沙星片，由深圳市天一科技开发有限公司研制、提供，规格400 mg/片，批号120702，药检合格。受试制剂B(TB):盐酸莫西沙星片，由深圳市天一科技开发有限公司研制、提供，规格200 mg/片，批号120702，药检合格。参比制剂R(RC)：盐酸莫西沙星片(拜复乐)，由德国拜耳先灵医药保健有限公司生产，规格400 mg/片，批号BJ06735，药检合格。

1.3样本量及给药方式采用SAS 9.3.1软件生成随机表，将24名健康受试者随机分为6组，每组4名，进行3个周期的自身前后交叉试验，分别于3个周期应用400 mg/片、200 mg/片两种规格的试验制剂和400 mg/片的参比制剂各1次，给药间隔为1周。

1.4纳入标准及排除标准纳入标准：(1)健康男性志愿受试者；(2)年龄18～40岁(年龄相差≤10岁)；(3)体重50～80 kg，体重指数19～24 kg/m2；(4)经体格检查血压、心电图、胸部X线片、实验室检查均无异常；(5)自愿参加试验并于试验前签署知情同意书。

排除标准：(1)因脑功能不全、精神发育障碍，不能与医护人员合作或交流者；(2)过去2年中有精神病史或药物依赖病史(烟除外)；(3)试验期间不能中断吸烟、饮酒；试验前7 d内用过任何药物，试验前2个月参加过其他药物临床试验；(4)试验前3个月内曾有过失血或献血达200 ml者；(5)有2种或2种以上药物过敏史，或有1种药物严重过敏史，对本试验用药或其成分过敏者；有晕针史者；(6)有心、肝、肾、消化道、神经系统、内分泌系统及骨骼肌肉等病史。

1.5样本采集受试者于试验前1 d入住药物临床试验病房，统一进食清淡的晚餐，22:00至第2天7:00禁食不禁水，7:00后禁食禁水；8:00空腹口服受试制剂或参比制剂，同时，以250 ml温开水送服。应用静脉留置针采集血样，受试者于3次用药前和用药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、24、32、48 h于上肢静脉取血4 ml，4 ℃条件下离心(3000 r/min)10 min，取血浆，立即置于-70 ℃冰箱中保存备测。

1.6血药浓度测定本研究采用RP-HPLC、荧光检测、内标-标准曲线法测定血药浓度。

1.6.1仪器Agilent高效液相色谱仪， G1322A在线脱气机，G1312A双元泵，G1367B自动进样器，G1316A柱温箱，G1315D DAD紫外检测器，G1321B荧光检测器，Rev.B.04.03化学工作站(美国惠普公司)；QB-600型高速漩涡混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；GL-88B型漩涡混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；HC-3018R高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；HC-2518R高速冷冻离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司；legend micro 21R高速冷冻离心机，赛默飞世尔科技有限公司；HPD-25无油真空泵，上海楚定分析仪器有限公司；KQ-100E超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.6.2试剂甲醇为色谱纯(Fisher，批号：083433)；二氯甲烷为分析纯(北京化工厂，批号：20120808)；屈臣氏蒸馏水(广州市屈臣氏食品饮料有限公司，批号：20121127)。空白人血浆由解放军第三〇二医院输血中心提供。

1.6.3色谱条件色谱柱Agilent Eclipse XDB-C18(250×4.6 mm I.D.，5μm)；激发波长296 nm，发射波长504 nm；流动相甲醇-0.05%三氟乙酸水溶液(40 ∶60，V ∶V)；流速1.0 ml/min；柱温25 ℃；进样量5 μl。

1.6.4血浆样本处理取血浆200 μl，加入内标溶液20 μl，涡流0.5 min，然后加入二氯甲烷2 ml，涡旋1 min,10 000 r/min离心10 min，取2 ml下层有机相于EP管中，37 ℃氮气吹干，100 μl甲醇-水(4∶6,V∶V)复溶，漩涡3 min，14 800 r/min离心10 min，取上清液80 μl于进样瓶中进行分析。

1.6.5分析测定方法确证

1.6.5.1特异性分别取6份不同来源的空白血浆各200 μl，除用40 μl甲醇代替内标溶液20 μl和待测物溶液20 μl外，其余步骤按“血浆样本处理”项下操作；将一定浓度的莫西沙星标准溶液和内标溶液加入空白血浆中，依同法操作；取1名受试者给药后收集的血浆样本，依同法操作，结果表明，空白血浆中的内源性物质不干扰莫西沙星和加替沙星的测定。

1.6.5.2线性范围取空白血浆200 μl，加入莫西沙星标准系列溶液20 μl，其余步骤按“血浆样本处理”项下操作，以血浆中待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为工作曲线。每个分析批建立一条工作曲线，每个浓度1个样本，连续测定6个分析批。莫西沙星的线性范围为0.02～10.00 μg/ml。结果见图1。

图1　莫西沙星的典型标准曲线

1.6.5.3定量下限取空白血浆200 μl，加入莫西沙星标准溶液20 μl使血中药物浓度为0.02 μg/ml，其余步骤按“血浆样本处理”项下操作，共6个样本，其RE值均在20%范围内，因此定量下限定为0.02 μg/ml。

1.6.5.4准确度与精密度按“血浆样本处理”项下操作，处理莫西沙星低、中、高3个浓度(分别为0.04、0.50、8.00 μg/ml)的QC样本，每个浓度6个样本，连续测定3个分析批，以同一分析批的工作曲线计算QC样本的浓度，根据QC样本结果计算本法的准确度与精密度。结果批内相对标准偏差(RSD)、批间RSD 均小于15 %。

1.6.5.5提取回收率按“血浆样本处理”项下操作，处理莫西沙星低、中、高3个浓度(分别为0.04、0.50、8.00 μg/ml)的QC样本，每浓度6样本，获得莫西沙星和加替沙星的峰面积。同时，各另取蒸馏水60 μl，加入莫西沙星低、中、高3个浓度(分别为0.04、0.50、8.00 μg/ml)的溶液和内标溶液，漩涡均匀，14800 r/min离心10 min后，取80 μl于进样瓶中进行分析，每浓度6样本，获得莫西沙星的峰面积和加替沙星的峰面积。以每一浓度前种处理方法所得莫西沙星的峰面积(各6个样本)除以后种处理方法所得莫西沙星的平均峰面积(每浓度6个测定值的平均值)，计算其提取回收率。低、中、高3个浓度血浆样品中莫西沙星的提取回收率分别为(80.93±1.51)%、(83.45±0.92)%和(87.40±3.75)%。以前种处理方法所得加替沙星峰面积(共18个样本)除以后种处理方法所得加替沙星的平均峰面积(18个测定值的平均值)，计算其提取回收率。结果血浆样品中内标加替沙星的提取回收率为(83.78±2.53) %。

1.6.5.6样本稳定性选择高、中、低3个浓度的质控样本，考察血浆样本在室温放置、处理后在进样器中放置、经过冻融3次循环、长期冰冻条件下的稳定性，以确定血浆样本的存放条件和时间。测定结果与标示量的RE应在±15%以内，定量下限附近浓度点的RE应在±20%以内。

1.6.5.7生物样本测定每个未知样本一般测定一次，必要时可进行复测。来自同一个体的生物样本最好在同一批中测定。每个分析批样本测定时应建立新的标准曲线，标准曲线的范围不能外延，任何浓度高于定量上限的样本，应采用相应的空白血浆稀释后重新测定。

1.6.5.8质量控制每个分析批样本测定时随行高、中、低3个浓度的质控样本。每个浓度至少双样本，并均匀分布在未知样本中。质控样本数大于未知样本总数的5%。质控样本测定结果的RE一般应在±15%以内，定量下限附近浓度点的RE可放宽至±20%。最多允许1/3的质控样本结果超限，但不能出现在同一浓度质控样本中。质控样本测定结果若不满足上述要求，则该分析批样本测试结果作废。

1.7数据处理

1.7.1药动学参数计算用DAS2.1.1软件处理血浆中莫西沙星的浓度-时间数据，用非房室模型方法计算药动学参数。列表提供每名受试者服用受试制剂、参比制剂后莫西沙星的主要药动学参数Tmax(实测值)、Cmax(实测值)、AUC0-t、AUC0-∞、T1/2等，及其均数与标准差。相对生物利用度(F)=(AUC受试制剂/AUC参比制剂)× 100%，分别以AUC0-t和AUC0-∞计算受试制剂的相对生物利用度F0-t和F0-∞。

1.7.2药动学参数分析用DAS2.1.1软件进行等效性评价，AUC和Cmax对数转换后进行显著性检验，然后用双向单侧t检验和90%置信区间的方法评价和判断药物间是否具有生物等效性。如有必要，Tmax采用配对Wilcoxon检验。经对数转换后若受试制剂和参比制剂AUC几何均值比的90%置信区间为80%～125%，且Cmax几何均值比的90%置信区间75%～133%，Tmax经非参数法检验，如无差异，可以认定受试制剂与参比制剂生物等效。Tmax不作为生物等效性判断的主要参数，如果Tmax差异有统计学意义，应分析是否具有临床意义，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1主要药动学参数其平均值见表1，受试制剂A(Ta)、B(Tb)与参比制剂Cmax、Tmax、AUC0-t、AUC0-∞平均值数值接近，差异无统计学意义。血浆中三种莫西沙星药物平均浓度-时间曲线见图2，各时间点浓度接近，两个受试制剂与参比制剂的平均相对生物利用度分别为(102.44±11.05)%和(101.58±11.93)%。

表1　24名受试者口服受试制剂和参比制剂

2.2生物等效性评价受试制剂和参比制剂的AUC0-t、AUC0-∞和Cmax对数转换后进行方差分析、双向单侧t检验和90 %置信区间计算，结果见表2和表3。方差分析结果表明受试制剂和参比制剂间AUC0-t、AUC0-∞、Cmax差异无统计学意义；双向单侧t检验结果表明受试制剂没有超过规定的参比制剂的高限和低限，拒绝无效假设(P<0.05)；90 %置信区间计算结果表明受试制剂均数在高方向没有大于或等于参比制剂均数的125 %，差异有统计学意义(P<0.05)，在低方向也没有小于或等于参比制剂均数的80 %(P<0.05)。所以TA、TB的药动学参AUC0-t、AUC0-∞、Cmax和Tmax均符合生物等效的判定标准。

表2　受试制剂和参比制剂的

图224名受试者血浆中莫西沙星平均浓度-时间曲线

表3　受试制剂(TA)、受试制剂(TB)和参比制剂(RC)的AUC0-t、

3讨论

盐酸莫西沙星属第四代新型氟喹诺酮类广谱抗菌药物，通过抑制细菌的DNA螺旋酶A亚单位和拓扑异构酶Ⅳ的活性，阻断DNA的复制，发挥杀菌作用[4]。莫西沙星对革兰阳性菌、革兰阴性菌、厌氧菌及非典型病原体(支原体、衣原体、军团杆菌)均有良好的抗菌活性，具有组织渗透力强、生物利用度高、作用时间长、不良反应少等优点[5]。目前，莫西沙星已被广泛用于慢性支气管炎、泌尿生殖系感染、急慢性鼻窦炎、皮肤和皮肤组织感染、肺结核及耐多药肺结核病等疾病的临床防治[2,3]。

目前，莫西沙星血浆药物浓度主要采用紫外、荧光、质谱或固相萃取技术等分析方法进行测定[3,5-12]。前期研究发现，采用高效液相色谱-紫外(HPLC- UV)法检测人血浆中莫西沙星的浓度，12名健康受试者口服莫西沙星后的主要药动学参数如下: AUC0-∞(40.55±8.71) μg·h/ml，Cmax(3.06±0.42) μg·h/ml，Tmax(1.75±0.76) h[13，14]；10名健康志愿受试者单剂量口服莫西沙星400 mg后，采用固相萃取-高效液相色谱方法测定盐酸莫西沙星的血药浓度发现，AUC0-36(111.8±10.3) μg·h/ml，Cmax(13.5±0.42) μg·h/ml，Tmax(3.13±0.32) h，二者之间有较大悬殊[15]。本研究采用RP-HPLC、荧光检测法测定三种莫西沙星药物的血药浓度发现，Cmax平均为(3.719～4.150) μg·h/ml，Tmax为(1.625～1.656) h，AUC0-∞为(46.281～47.163) μg·h/ml，与应用高效液相色谱- 紫外(HPLC- UV)法检测人血浆中莫西沙星的浓度相似。

本研究建立的RP-HPLC、荧光检测、内标-标准曲线方法测定血浆中莫西沙星的浓度，具有样品处理简单、灵敏度高、干扰少等优点，经方法学验证，符合生物样品中药物浓度分析方法的要求[16]。经用DAS2.1.1药动学分析软件分析，莫西沙星400 mg组与参比药物符合生物等效性假设，说明两种药物的吸收速度及吸收程度相似。本项研究结果表明，国产莫西沙星制剂与参比制剂具有生物等效性。

【参考文献】

[1]卢定强,王维胞,凌岫泉,等.新一代喹诺酮类盐酸莫西沙星的合成及应用研究进展[J].现代化工,2014,34(2):33-37.

[2]赖书华. 莫西沙星的药理特性及最新应用进展[J]. 中国医院用药评价与分析,2010,10(8):682-683.

[3]梅和坤,王睿,白楠.HPLC-MS/MS法测定血浆中莫西沙星浓度[J].中国药物应用与监测,2013,10 (2):83-86.

[4]宋秀杰,刘又宁,梁蓓蓓,等. 20种抗菌药物对肺炎链球菌的体外抗菌活性研究[J].中国药物应用与监测,2010,7(1):20-23.

[5]陈漪,施家威,金米聪.液相色谱-离子阱质谱法测定人血清中莫西沙星浓度[J].中国临床药学杂志,2009,18(6):345-348.

[6]张吟,陈一农,陈文发.固相萃取-高效液相色谱法测定人血清中莫西沙星浓度[J].中国医院药学杂志,2007,27(4):481-483.

[7]贺德辉,余江平. RP-HPLC法测定人血浆中莫西沙星的浓度[J].中国药房,2007,18(32):2506-2507.

[8]张翠莲,Nightingale C H, Nicolau D P. 反相HPLC测定培养基中莫西沙星含量的方法学研究[J].中国药学杂志,2004,39(9):699-701.

[9]Wagenlehner F M, Kees F, Weidner W,etal. Concentrations of moxifloxacin in plasma and urine, and penetration into prostatic fluid and ejaculate, following single oral administration of 400 mg to healthy volunteers[J]. Int J Antimicrob Agents, 2008, 31(1):21-26.

[10]林光勇,朱光辉,王增寿,等.反相高效液相色谱法测定莫西沙星的人体血药浓度[J].中国药业,2011,20(22):42-44.

[11]王启东,李东,徐玉红,等.高效液相色谱法测定人血浆中莫西沙星浓度[J].中国药师,2009,12(11):1537-1539.

[12]陈慧敏,赵建波,刘涛. HPLC-UV法检测人血浆中莫西沙星的浓度[J].浙江实用医学,2010,5(5):402-404.

[13]徐玉红,李玉珍,李东,等.盐酸莫西沙星片的人体药动学研究[J]. 中国药房,2010 ,21(10):898-901.

[14]姚苑梅, 徐玉红,李东,等.盐酸莫西沙星片在健康人体的药动学研究[J].中国药师,2010,13(6):793-796.

[15]张卫,苏东晖,钟华玉.盐酸莫西沙星片剂的血药浓度及药动学分析[J].福建医药杂志,2013,35(3):68-71.

[16]郭喆,史小四,朱哲,等. 瑞舒伐他汀钙胶囊人体生物等效性研究[J].武警医学,2012,23(7):567-571.

(2014-10-09收稿2014-12-20修回)

(责任编辑郭青)

论著

【摘要】目的探索国产莫西沙星片与原研产品“拜复乐”是否具有生物等效性。方法采取随机、阳性对照、开放、自身三交叉的临床试验研究，24名健康受试者随机三交叉口服试验药物莫西沙星400 mg(TA)、200 mg×2片(TB)及参照药品“拜复乐” 400 mg(RC)，清洗期1周，受试者于3次用药前和用药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、24、32和48 h于上肢静脉取血4 ml，应用RP-HPLC、荧光检测、内标-标准曲线法测定血药浓度，采用DAS 2.1.1程序拟合药动学参数，并进行生物等效性评价。结果TA的药动学参数为Cmax(4.15±1.17)μg/ml，Tmax(1.64±0.94) h，AUC0-t(47.16±6.14) μg·h/ml，AUC0-∞(50.17±7.01)μg·h/ml；TB的药动学参数为，Cmax(3.71±0.94)μg/ml，Tmax(1.65±0.99)h，AUC0-t(46.68±6.01)μg·h/ml，AUC0-∞(49.73±7.15)μg·h/ml；RC的药动学参数为，Cmax(3.82±0.78)μg/ml，Tmax(1.62±1.01) h，AUC0-t(46.28±6.02) μg·h/ml，AUC0-∞(49.27±6.97)μg·h/ml，经方差分析，三组无统计学差异，经双向单侧t检验结果表明，受试制剂没有超过规定的参比制剂的高限和低限，差异无统计学意义；90 %置信区间计算结果表明受试制剂Cmax、Tmax、AUC0-t和 AUC0-∞均数为参比制剂均数的80%～125%。结论TA、TB的药动学参数AUC0-t、AUC0-∞、Cmax和Tmax与RC比较均符合生物等效的判定标准。

【关键词】莫西沙星；生物等效性；健康人体

【中国图书分类号】R969.4

Bioequivalence of moxifloxacin tablets in Chinese healthy volunteers

GUO Zhe,ZHU Zhe,SHI Xiaosi,and QIANG Lieying.Department of Pharmacy，Second Hospital of Beijing Municipal Corps, Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100036, China

【Abstract】ObjectiveTo study the bioequivalence of moxifloxacin tablets (test tablets) compared with the innovator preparation (reference tablets) in Chinese healthy volunteers．MethodsRandomized, positive control, open, three-cross clinical trials were performed. 24 healthy subjects were randomized to undergo three crossover oral test drugs including moxifloxacin 400 mg (TA), 200 mg*2(TB) and the reference drug 400 mg (RC). A 4 ml blood sample was taken at every time at 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 6, 8, 12, 24, 32 and 48 h before and after treatment. The plasma concentration of moxifloxacin was determined by RP- HPLC, fluorescence detection and internal standard - standard curve method. DAS 2.1.1 software was used to calculate the pharmacokinetic parameters and evaluate the bioequivalence. ResultsPharmacokinetic parameters for the TA were Cmax(4.150±1.17) μg/ml，Tmax(1.646±0.94) h，AUC0-t(47.163±6.14) μg·h/ml，AUC0-∞(50.171±7.01)μg·h/ml. Pharmacokinetic parameters for the TBwere Cmax(3.719±0.94) μg/ml，Tmax(1.656±0.99) h，AUC0-t(46.686±6.01) μg·h/ml，AUC0-∞(49.737±7.15)μg·h/ml. Pharmacokinetic parameters for the RC were Cmax(3.827±0.78)μg/ml，Tmax(1.625±1.01) h，AUC0-t(46.281±6.02) μg·h/ml，AUC0-∞(49.276±6.97)μg·h/ml. The three groups had no statistical difference by the analysis of variance, and the two-way unilateral t-test results showed that the test preparation did not exceed the prescribed upper limit and lower limit of the reference preparation, rejecting null hypothesis (P<0.05). The 90% confidence interval of Cmax，Tmax，AUC0-tand AUC0-∞were between the standard of reference tablets ( 80%-125%)．ConclusionsThe pharmacokinetic parameters of TA, TBare conform to the biological equivalent decision criteria compared with RC.

【Key words】moxifloxacin; bioequivalence; healthy body

作者简介：郭喆,本科学历，主任药师，E-mail:guozhegg@sina.com