脂肪酶的制备及其在皮革工业中的应用

周秀军，周利芳，周建民，隋喜龙（威海天智皮毛制品有限公司，山东文登264400）

脂肪酶的制备及其在皮革工业中的应用

周秀军，周利芳，周建民，隋喜龙
（威海天智皮毛制品有限公司，山东文登264400）

摘要：来源于微生物的脂肪酶在皮革工业中的应用具有无可比拟的优势。本文综述了产酶菌株的筛选（观察透明圈和变色圈）、选育（驯化、诱变或者基因工程手段）和分离纯化技术（膜处理、层析、免疫纯化、双水相萃取、反胶团萃取等）。使用脂肪酶处理的皮革颜色均匀、表皮清洁，产品在防水性和低雾化等方面较优。

关键词：脂肪酶；菌株筛选；菌株诱变选育；分离；纯化

1　前言

脂肪酶（Lipase, EC 3.1.1.3），也称三酰基甘油酰基水解酶，广泛存在于动、植物和微生物体内，是一类水解和合成长链脂肪酸甘油酯的生物催化剂，在油脂加工、洗涤、食品加工、医药、化妆品、皮革加工、饲料、造纸、有机合成、精细化工以及生物能源等诸多领域有着广泛应用[1]。

脂肪酶不仅可水解三脂酰甘油生成二脂酰甘油和脂肪酸，而且能催化水解反应的逆反应-酯化反应。由于具有应用范围广及易于生产等特点，微生物脂肪酶已经成为一类在生物技术方面具有重要应用价值的产品，脂肪酶是继蛋白酶和糖酶之后的第三大类具有应用价值的酶，应用范围很广，每年脂肪酶的交易额有10亿美元[2-3]。

2　脂肪酶的来源

表1　主要产脂肪酶的微生物

脂肪酶是科研研究中被关注最早的酶类之一，已经有100多年的历史[4]。脂肪酶广泛存在于动物、植物组织中及微生物中，尤其是微生物所产的脂肪酶有很多方面的优势，例如，能够不被季节、气候等环境的因素所影响，有利于连续进行工业化的发酵生产；产酶所需的周期短、发酵获得的产物比较单一，易纯化；微生物脂肪酶具有异构体选择性、耐有机溶剂、高度位置选择性、底物专一性和高催化活性等特点[5]。因此，微生物来源的脂肪酶研究有很高的实际应用价值，引起各国科研人员的广泛关注，在理论研究上的发展迅速，带动了脂肪酶在工业生产实际开发中的应用[6]。目前脂肪酶的研究已成为酶学研究者关注的重点，使其在食品及医药生产、油脂的水解和改性、皮革的脱脂以及化妆品添加剂等各个方面得到了非常广泛的应用[7]。

表1列举了一部分国内外已经报道的主要产脂肪酶的微生物种类[8]。

3　脂肪酶生产菌株的筛选及诱变选育

3.1脂肪酶生产菌株的筛选

目前筛选产脂肪酶菌株的方法追求的是快速、准确、简捷、选择性强等特点，依据应用对象、微生物的种类和酶特异性的不同，对于能够生产脂肪酶的微生物菌株的筛选方法也各有特色。筛选脂肪酶菌常用的方法是采用含甘油三酯琼脂平板。首先采集含油污土壤样品或其它杂物如油垢、废油布等，无菌水梯度稀释样品，涂平板，培养，观察平板上菌落周围透明圈或通过在培养基中添加指示剂如罗丹明B、澳甲酚紫、维多利亚蓝等作为筛选标记，观察变色圈的大小。透明圈和变色圈的有无与大小说明菌株产脂肪酶的能力，即透明圈和变色圈越大，菌株产脂肪酶能力可能越大[9]。

（1）观察透明圈的方法。将处理好的样品均匀地涂布在含有甘油三酯的固体平板上，根据菌株的直径与透明圈直径的比率，确定菌株产脂肪酶的能力大小。如Cardena等[10]、宋欣等[11]将从土壤中采集到的样品先进行富集培养，然后吸取一部分富集液均匀涂布在含有橄榄油成分的初筛用的平板上，待菌体长出后观察平板上菌落周围透明圈的大小来选定所需要的菌株；王美英[12]、谢舜珍等[13]则是选用油同化的平板，即利用油脂作为碳源并且是唯一的碳源进行同化试验，均筛选出了活性比较高的产脂肪酶的菌株。

（2）观察变色圈的方法。在固体培养基中加入指示剂作为筛选标记，观察菌落周围变色圈的大小，其变色圈越大，说明此菌株生产脂肪酶的能力越大。常用的指示剂主要有三种，分别是溴甲酚紫，罗丹明B和维多利亚蓝。例如Yeoh等[14]利用可生色的底物筛选得到了对不同碳链长度脂肪酸具有特异性的产脂肪酶的菌株；马抒晗等[15]以橄榄油为唯一碳源、罗丹明B为指示剂的培养基进行初筛，摇瓶发酵复筛，从70份含油脂丰富的样品中筛选出

产脂肪酶酶活较高的菌株；施巧琴[16]、张婵等[17]利用脂肪酸能够与维多利亚蓝反应，从而呈现出蓝绿色透明圈的原理，筛选出能够产脂肪酶的菌株；李春华[18]的初筛过程则是以维多利亚蓝B作为指示剂，复筛过程是以罗丹明B作为指示剂，最终也筛选获得了能够产脂肪酶的菌株。

3.2脂肪酶高产菌株的选育

从自然环境中经过简单筛选而分离得到的产酶菌株虽然具备了一定的产酶能力，但是要达到某种特定代谢产物的大量积累，实现优质、高质量和低消耗的高效转化，则需要对菌株进行选育或改良，以提高脂肪酶产量或者解除、突破微生物自身的代谢调控。提高菌株脂肪酶产量的途径，主要有菌种改良和发酵工艺优化两种途径[19]（发酵工艺优化不在本文讨论范围内）。菌种改良的途径主要有菌种驯化、诱变育种和基因工程改造等。

3.2.1菌种驯化

通过定向诱导以及贫瘠培养驯化可使产酶菌株对简单底物的利用能力加强，在一定程度可以提高菌株的产酶活力。与发酵工艺优化有异曲同工之处，同时它也是退化菌种复壮的常用手段之一。

3.2.2诱变育种

诱变育种是微生物改良的常用方法，就是利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在大大提高其突变频率的基础上，采用适当的筛选方法获得所需要的突变菌株，以供科学实验和生产实践使用[20-21]。

诱变剂的种类很多，主要使用的有物理诱变剂和化学诱变剂。目前，以紫外线、亚硝基胍、亚硝酸、硫酸二乙酯、快中子等理化因子作为诱变剂，利用低温、溴化乙锭、胆盐、制霉菌素、克霉唑、柠檬酸钠、琥珀酸钠、丁酸、己酸、三丁酸甘油酯等作为正突变筛选剂的诱变策略，已成功应用于扩展黑曲霉、青霉、假单胞菌、酵母等多种产脂肪酶菌株的诱变筛选。采用上述诱变和筛选方法,一般可以将脂肪酶产量提高1～10倍，最高可达40倍[22-23]。

3.2.3构建脂肪酶基因工程菌

利用基因工程改造菌株主要有随机突变与定点突变两种方式。随机突变即通过诱导不同突变产生大量突变菌株，再根据不同目的利用有效的筛选方法得到产酶量大幅提高的突变株。定点突变是筛选具有某一相关特性的变异株，再从其中筛选或诱导出高产菌株，从而可大大提高筛选品质和效率，且一定程度上克服了诱变育种的盲目性。目前，利用分子生物学手段筛选脂肪酶高产菌株己受到研究人员的重视[24]。通常情况下利用常规育种方法难以满足工业化生产的需要，通过基因工程手段克隆脂肪酶基因，并研究其基因表达调控，可以大幅提高脂肪酶的产量。大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和曲霉表达系统是目前应用最为广泛的三种异源表达系统，许多脂肪酶基因均在这些表达系统中实现了大量表达[25]。此外，通过改造脂肪酶基因及分泌蛋白基因以提高脂肪酶产量、活性和稳定性也有许多成功的报道[26]。微生物脂肪酶的高效生产仅仅靠脂肪酶基因的高效表达还是不够的，还需要酶蛋白质的有效折叠和分泌，基因工程技术和新生产技术的联合使用改善了工业用酶的性能，提高了产品质量，降低了生产成本，同时也减少了对环境的影响。

4　脂肪酶的分离与纯化

酶的分离纯化是指将酶从细胞，或者其他酶原料中提取出来，并且与杂质分开，从而获得符合目的要求的酶制品的过程。主要包括细胞的破碎，目标酶的提取，提取物的离心分离、过滤与膜分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，浓缩，干燥，结晶等[27]。

大部分微生物脂肪酶均为胞外酶，发酵后通过离心或抽滤除去菌体，得到的含酶上清液通过硫酸铵沉淀或有机溶剂萃取浓缩，除去部分杂蛋白质和糖类，然后再用层析法进一步纯化。除了少部分基因工程菌能够高效表达功能性脂肪酶，绝大部分野生型菌株都要联合两种以上的层析方法纯化才能获得预期纯度的蛋白质[20，28]。目前，脂肪酶的分离纯化技术主要包括膜处理技术、层析技术、免疫纯化

技术、双水相萃取、反胶团萃取技术及纳米机破碎法等。

4.1膜处理技术

膜的错流过滤可以从培养基中分离失去生物活性的细胞，应用于脂肪酶的纯化，能够浓缩含有脂肪酶的上清液。目前，具有毛细作用的超滤膜主要研究聚丙烯腈（PAN）和聚砜（PS）两种，以往的研究发现，透过这两种膜的脂肪酶流量明显减少，这种影响在亲水的PAN膜上尤为明显，可纯化15倍；而在PS膜上却并不十分显著，仅可纯化3倍；因此，PS膜更适宜用于浓缩酶，而PAN膜则常用于分馏酶。在PAN膜上，15%的蛋白质可以被吸收，这些蛋白质具有30%的活性；而在PS膜有30%的蛋白质能够被吸收，这些蛋白质具有40%的活性。经过超滤膜处理的蛋白质损失为15%～30%，酶活损失为30%～40%[29]。

4.2层析技术

传统分离方法的层析技术包括离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析。脂肪酶产生菌株中只有少数基因工程菌能够将功能性脂肪酶高效表达，大部分微生物脂肪酶产生的菌株是野生型菌株，产生的酶成分复杂，单一纯化方法很难得到较高纯度的酶蛋白。由此看来，两种或多种层析方法联合进行，并进行多步纯化是必要的。

4.3免疫纯化技术

免疫纯化是一种极具亲核力和高选择性的高效纯化方法，这种方法经一步反应将酶纯化1 000 ～ 10 000倍[30]。高效的抗体可以分离性质十分相似的抗原，而且克服了许多其他方法无法解决的难题。但是免疫纯化法费用昂贵。

4.4双水相萃取技术

双水相（Aqueous Two phase System，ATPS）是指不同种类聚合物溶液混合或者聚合物水溶液和盐溶液混合且当聚合物和盐浓度达到一定值，混合液静置后分层产生两液相或多液相系统[31]。

4.5反胶团萃取技术

近年来，在非水相提取方面发展的一项新技术为反胶团提取生化物质。AOT(二(2-乙基己烷)丁二酸磺酸钠)/异辛烷反胶团从发酵液中萃取脂肪酶[30，32-34]。

5　脂肪酶在皮革脱脂中的应用

脂肪酶最早的应用是利用它来分解油脂以释出短链脂肪酸，以增加或改进食品的风味，促进干酯熟化，也可以生产代可可脂；利用脂肪酶可催化水解脂类生产脂肪酸和甘油，也可催化酯化反应获得一些特殊的脂类物质；随着非水相酶学的深入研究大大拓展了脂肪酶的应用领域，利用其在有机相中所催化的反应已合成许多高价值产品[35-36]。

脱脂是处理动物生皮中一个基本的步骤。脂肪酶可以去除皮中的油脂。酸性和碱性的脂肪酶都可以用来脱脂。脂肪酶水解甘油三磷酸(甘油三磷酸是动物皮中的主要储存物)为甘油和游离的脂肪酸。加入碱稳定的蛋白酶可以更加有效地去除细胞膜和皮脂腺上的脂肪化合物。脱灰和软化也可使用脂肪酶。经过盐渍的皮革可以用酸性脂肪酶来处理[37]。使用脂肪酶的优点在于可以使皮革颜色均匀、表皮清洁。

碱性脂肪酶用于浸水和浸灰时，与蛋白酶联合使用效果更好。使用脂肪酶脱脂在大多数情况下没有必要再使用表面活化剂，这有助于产品的防水性和低雾化。酸性脂肪酶可以用于盐渍的原皮或蓝湿皮处理。在制革工业中，传统的动物皮处理使用石灰和硫化钠的混合物来脱毛，这种方法操作麻烦并且容易产生污染。皮上的残余脂肪和蛋白通过化学过程如浸灰等来去除效果不好[38]。为此，使用脂肪酶和蛋白酶混合软化己经成为惯例[39]。酶可以松散并且去除皮革上的毛，然后通过过滤除去。这样最终产品要比传统方法生产的皮革质量高很多。

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基金资助：国家星火计划（2013GA740002）

Progress in Preparation of Lipase and its Application in Leather Industry

ZHOU Xiu-jun, ZHOU Li-fang, ZHOU Jian-min, SUI Xi-long
(Weihai Tianzhi Fur Products Co., Ltd. Wendeng 264400 ,China)

Abstract:Application of lipase prepared from microorganisms in leather industry exhibits outstanding advantages. This review introduces the strain selection methods such as observation for transparent circle and colouring circle, breed methods including domestication, mutation and genetic engineering, and separation and purification techniques, e.g. membrane treatment, chromatography, immune purification, aqueous two-phase extraction, and reverse micelle extraction technologies. The obtained leather with lipase treatment possesses more uniform color, cleaner grain, better waterproof property and lower fogging value.

Key words:lipase; strain selection; mutation breeding of strain; separation purification

作者简介：第一周秀军（1970 -），男，山东文登人，本科，主要从事毛皮动物养殖和毛皮加工工作，E-mail：zhouxiujun888@sina.com。

收稿日期：2015-09-27

中图分类号：TS 529.1

文献标识码：A

文章编号：1671-1602（2015）20-0016-05