一个生态良性的鞣前操作架构：酶脱毛和松散纤维紧密系统

Jayakumar Gladstone Christophera, Sivaraman Ganesh , Saravanan Palanivel等著姜志伟编译

一个生态良性的鞣前操作架构：酶脱毛和松散纤维紧密系统

Jayakumar Gladstone Christophera, Sivaraman Ganesh , Saravanan Palanivel等著
姜志伟编译

摘要：由于会产生大量的固体废弃物，皮革生产过程中的鞣前操作总是一个具有挑战性的工作。清洁生产是消除现有制革污染问题的新途径。在清洁皮革加工技术背景下，酶是传统化学品的最好替代者。目前研究在鞣前操作中使用酶，蛋白酶用于脱毛，淀粉酶用于除去纤维间质。蛋白酶和淀粉酶可以复配和单独用于传统的浸灰和脱灰工序。在转鼓中复合酶用量3.5%最佳。脱毛效果和纤维松散程度通过孔隙尺寸和污染负荷来评价，形貌特征通过染色和扫描电镜观察分析评价，也评价了坯革的物理力学性能、感官性能和视觉效果。就脱毛和一般外观而言，复合酶的脱毛效果与传统脱灰系统相当。酶脱毛后蓝湿革收缩温度约为112益，成革的力学强度符合联合国工发组织（UNIDO）规范。扫描显微电镜证实纤维未损伤变形。酶处理过程中，纤维紧实、松散及分布均匀。单一的酶处理步骤降低了污染负荷。本研究揭示了制革工业中酶的作用，并对现有的清洁生产系统提供了一个新的生物资源利用途径。

1　前言

为了满足污水排放限值，皮革工业面临着来自污染控制部门严格的规定。众所周知，皮革生产会产生大量的固体和液体废弃物。研究者把精力主要集中在研发一系列清洁技术，最大限度地减少制革对环境的负面影响。制革者主要关注准备和鞣制工段产生的高污染。传统制革过程每kg原皮消耗约25～30 L水，随后作为废水与污染物质一起排出。浸水至软化操作主要目的是清洁皮质，先决条件是皮质和不想要的物质结合不牢容易除去，以此减少湿操作和涂饰的化料用量。浸灰是准备工段的重要操作之一，它可以脱毛、去肉、分散纤维束。传统的灰碱法产生大量的硫化物废物，对人类身体健康有害且难处理。此外，传统的灰碱毁毛法导致废水中的高COD、BOD、TDS负荷。酶法脱毛通过有选择性地破坏胶结物质松动毛根，并可回收毛。酶的应用立体专一，中性pH条件下有活性，减少污染负荷，且有回收利用的可能性。酶法在脱毛和松散纤维方面的主要优点是：完全消除石灰和硫化钠的使用；回收高质量的毛；较好的强度性能；增加得革率和显著缩短作用时间。除浸灰外，准备工段其他重要的操作旨在除去纤维间质（主要是蛋白多糖，用碱性蛋白酶促进去除）。

酶常用于制革工业的脱毛。然而，为了确保充分松散纤维，酶处理后又要进行复灰，这导致污染负荷受到深切关注。本研究尝试使用一种混合酶制剂复合酶（蛋白酶和淀粉酶混合配方）脱毛和松散纤维，处理流程如图1所示。在转鼓中进行，以缩短作用时间。

2　材料和方法

2.1材料

采用盐湿山羊皮（4～5平方英尺），制革所用的化学品均为商业级，化学分析所用试剂为分析纯。复合酶复合酶（蛋白酶和淀粉酶混合配方）由M/s United Alacrity (I) Pvt有限公司提供（蛋白酶活性100 U/g，淀粉酶活性1 000 U/g）。牛血清蛋白（BSA）、粘蛋白、Folin ciocelatu试剂、高碘酸由印度Sigmae Aldrich Chemicals提供，其他分析试剂由印度

SD Fine Chemicals提供。

图1　制革的传统和试验流程

2.2对处理过程释放的蛋白和蛋白多糖定量分析

取5张山羊盐湿皮（腌制1天的）进行酶脱毛和松散纤维试验（如表1所示）。加酶前将浴液pH调至8.5～9.0以便有效脱毛且分散纤维。所有实验样液用Whatman滤纸过滤。根据标准程序，用分光光度法对过滤后样品中的蛋白和蛋白多糖进行评估。

2.2.1用Bradford法评估蛋白质

用Bradford法评估废液中的总蛋白含量。Bradford试剂的制备是将考马斯蓝G溶于乙醇和磷酸中。废液样品用Bradford试剂孵育，并用量热法在595 nm读数。利用BSA标准液制作标准工作曲线，用标准曲线计算出酶作用过程废液样品中的蛋白含量。

2.2.2蛋白多糖的评估

高碘酸氧化复合多糖可以通过席夫碱检测来评估。用粘蛋白作为标准品制作标准曲线，通过粘蛋白标准曲线计算出废液样品中的蛋白多糖含量。

2.3酶处理山羊皮纤维孔隙尺寸评估分析

表1　复合酶应用工艺配方

按Fathima等人描述的方法进行热孔分析。TA仪器在-40～10℃范围，升温速率1℃/min条件下进行，每次测量前检查基线的稳定性。放有样品的密封封装铝盘放入一个装有DSC电池量热仪的加热装置内。使用这一技术的优点是皮可以在湿态下测量。传统的复灰裸皮（空白试验）同样用此法测量。

2.4染色技术

组织病理学实验室经常使用苏木精和曙红(H&E)染色，这样病理学家或研究人员能够非常详细地观察所研究的组织。虽然出现了几种染色新技术，H&E染色被认为是研究组织试样的关键。对复灰和复合酶处理后的裸皮进行染色观察，以了解其纤维取向。用光学显微镜和数码相机成像分析，捕获每个样品的彩色影像。

2.5酶处理废液分析

收集酶处理废液，依照标准程序分析COD，取三个平行试验的平均值。

2.6铬鞣

酶处理后的皮彻底水洗，按传统方法浸酸。酶处理过程pH约8～9，省去了脱灰和软化过程，没有用石灰。浸酸裸皮随后按传统方法用6% BCS铬鞣剂鞣制（表2所示）。收集废液，分析铬的吸收率，这也间接证明皮纤维的松散程度。

2.7收缩温度测定

表2　铬鞣工艺配方

衡量皮革湿热稳定性的收缩温度用Theis收缩试验仪测定。从鞣制好的皮革上切取2 cm2的试样，用夹爪两头夹住依次浸入水：甘油混合物（3∶1）溶液中。溶液用机器强力搅拌，溶液温度逐渐升高，记录试样收缩时的温度。

2.8鞣后操作

鞣制后的革削匀成1.1～1.2 mm的均匀厚度，头层革鞣后操作如表3所示。然后堆放过夜，第二天伸展、绷板干燥、整软、磨革。

2.9皮革样品的物理测试

依据IULTCS方法对皮革样品进行物理测试。将皮革样品在26℃，相对湿度65%条件下调节48 h，根据标准方法测试其物理性能如抗张强度、伸长率、撕裂强度和粒面脆裂强度。每一个给出的值是四次测量的平均值（两个纵向，两个横向）。

2.10感官特性评价

通过感官评价鞋面革的柔软性、粒面平滑性、丰满性和外观进行评价。三个经验丰富的制革人员对皮革的每项性能进行打分，分值为0～10分。

2.11坯革扫描电子显微镜分析

空白和试验坯革样品按规定的取样位置取样。按照标准程序，试验样品先用水洗，然后用丙酮和

甲醇逐渐脱水。用Quanta 200扫面电子显微镜进行分析。通过在5 kV加速电压和不同放大倍数下操作扫面电子显微镜，获得粒面和横截面显微照片。

表3　蓝湿革制作鞋面革鞣后操作配方

2.12统计分析

物理强度性质试验一式三份，数据为平均值± SD，p＜0.05就认为是显著的。统计分析使用Student's t-test。

3　结果与讨论

3.1同步脱毛和松散纤维酶配方的标准化

酶脱毛和松散纤维过程的优化有赖于酶的浓度。基于酶的活性，采用了四种不同的酶浓度：2.5%、3.0%、3.5%、4.0%（以山羊原皮质量计）。同步脱毛和纤维松散过程按表1进行，包括用300%的水两步浸水，接着使用30%的水、2.5%～4.0%的酶浓度转鼓中进行酶处理。总时间6 h，每小时转10 min，停50 min。然后在转鼓中静置过夜（12 h）。早期的研究报道需要24 h才能完全脱毛。图2显示了本实验的作用时间、脱毛效率、纤维松散程度和裸皮质量。从图中可以看出，复合酶用量3.5%和4.0%脱毛完全，而酶用量2.5%和3.0%，脱毛不完全。复合酶用量2.5%时因浓度低气味小。根据评估研究，复合酶用量3.5%时脱毛效果较好，粒面平滑，气味较小。因此将复合酶最佳用量定为3.5%。进一步研究，根据蛋白多糖的释放、铬的吸收率、革的力学性能、皮中纤维的形态分布来评价酶的作用效果。苏木精和伊红染色方法用于皮革制备过程中直观视觉评估纤维取向。通过热孔分析试验了解酶处理时孔隙大小分布（增加或减少）。还进行了铬吸收、污染负荷和经济分析，以了解酶的重要性。本研究对同步脱毛和松散纤维过程提供了定性和定量评估。

3.2酶处理后释放的多糖

表4　释放于废水中的蛋白和多糖

图2　复合酶处理后山羊皮评估等级

在传统复灰过程中多糖的释放量是纤维松散程度的标志。通过评估废液中释放的多糖和蛋白质来检验复合酶松散纤维的程度。淀粉酶对催化水解分裂特定的糖苷键具有高度特异性。当用淀粉酶处理皮时，最初可能显著影响皮基质蛋白多糖糖苷键的断裂，特别是与胶原基质键接的蛋白多糖。使用它们的标准曲线和表4给出的数据可计算多糖和蛋白质的浓度予以评估。由于酶的活性，废液中释放的大量的蛋白和多糖。由于白蛋白和球蛋白的释放以及酶的存在，酶处理液中蛋白浓度较高。试验观察到的结果与Madhan等人在传统浸灰过程中观察到的结果一致。然而，对废液进行羟脯氨酸含量测试，以检测皮质是否由于酶的作用而降解，结果显示本试验废液中未检出羟脯氨酸。这表明脱毛和松散纤维过程中皮质未被降解。

3.3复合酶处理后山羊皮的孔隙尺寸评价

图3　复灰（A)和复合酶处理(B)山羊皮孔隙尺寸分布

在皮革生产过程中，皮的孔隙尺寸是重要的因素之一。鞣剂、加脂剂、染料、复鞣剂等化学品的扩散主要通过皮的孔隙进入皮内。通常，皮的孔隙充满了纤维间质如弹性蛋白、网状蛋白、蛋白聚糖与非胶原纤维蛋白。这些材料对于皮实现其生理功能是非常重要的。在皮革生产过程中，这些纤维间质阻止了化学品的扩散。所以，为了使化学品能在皮中较好地扩散，需要除去这些物质。酶松散纤维选择性裂解纤维间质，确保均匀裂解出蛋白多糖。图3A 和3B显示了酶和石灰处理后山羊皮的孔隙分布。从图中可以看出，酶处理明显有助于打开皮的孔隙，酶处理的皮孔隙尺寸分布更均匀，其范围从10～100 nm，而空白试验是10～50 nm。孔隙尺寸分布均匀就能保证化学品扩散均匀，成革的表面粒纹就均匀。传统的准备操作，孔隙尺寸分布被限制在60 nm，而酶松散纤维过程中裸皮孔隙尺寸分布范围从10～100 nm。

3.4复合酶处理山羊皮的组织学特征

将原料皮、复灰皮、复合酶处理皮用苏木精和曙红（H&E）进行染色，以研究皮在脱毛和纤维松散后的组织学特征。组织学研究揭示酶处理前后皮质中纤维取向的致密性。染色的差异性表明皮在不同处理阶段的纤维取向。用福尔马林固定的充水皮样沿毛囊切割成7 μm厚的薄片，然后用H&E染色，置于光学显微镜下观察。这些彩色图像可以视觉观察到皮纤维间质去除情况。图4 A-C为原料皮、脱灰皮和复合酶处理皮的染色图像。从图中可见，皮质由胶原蛋白、网状蛋白、弹性蛋白和其他非胶原蛋白组成，真皮区的纤维取向比原料皮更有序。复灰的皮纤维比酶处理的更松

弛，这主要是由于石灰的感胶离子效应影响。复灰皮和酶处理皮纤维取向一致，这表明皮中的非胶原基质被选择性去除了。这证实酶处理的裸皮与传统复灰裸皮相似，不影响材料的强度。

图4　H&E染色原料皮（A）、复灰皮（B）和复合酶处理皮（C）的显微照片

3.5酶处理废液特性

按标准程序分析酶处理废液的COD值，给出的值为三个平行试验的平均值。酶处理废液的COD约为8 000 mg/kg，而传统过程约为26 432 mg/kg。传统处理过程的值较高是由于毛的降解对COD贡献较大。反之，酶处理不仅回收毛，且不使用石灰和硫化钠，因此其废水中的COD显著降低。这证明了复合酶脱毛和分散纤维的效果。这种方法可以彻底消除石灰污泥和有毒气体。传统复灰裸皮通常要进行脱灰以去除复灰阶段添加的石灰。脱灰时会释放有害气体。因此，复合酶处理的另一个优点是避免了脱灰，裸皮直接进行浸酸。这种方法明显地减少了化学品的使用，降低了污染负荷，省掉了目前的脱灰、软化过程。

3.6蓝湿皮中的铬含量

复合酶处理后按传统方法进行鞣制。然后陈放过夜，评价其各种性能如铬含量、皮对铬的吸收率。复合酶处理后鞣制的皮铬含量为3.9%，皮对铬的吸收率约89%，湿热稳定性约为112℃，铬含量和收缩温度都比较高。铬吸收率高主要是由于酶处理过程纤维束分散比较好，去除纤维间质好。

3.7蓝湿革的视觉评估

在皮革生产的不同阶段，裸皮呈现出不同的形态。不同等级的皮革价格也不同。发生形态改变主要是在蓝湿革阶段。因此，这一阶段出现的任何缺陷都会影响皮革的质量，需要在湿操作后的涂饰工序中需要加以弥补。在铬鞣后期会遇到铬斑和铬吸收不好的问题。为了建立酶处理蓝湿皮的最终质量诊断，进行了视觉评估，结果列于表5。所有的指标即粒面平滑性、色泽、铬斑和外观都不错。综合评价结果表明，酶处理的皮革和传统方法处理的皮革一样没有铬斑，且外观优于传统方法处理的皮革。

表5　蓝湿革的视觉评估数据

3.8坯革的物理性能

复合酶处理后，坯革的力学性能如抗张强度、撕裂强度和粒面崩裂强度列于表6。山羊面革的抗张强度为260 kg/cm2，撕裂强度43 kg/cm。酶处理后坯革的粒面崩裂强度符合规范。根据联合国产业发展组织规范，强度特性表明复合酶处理后的皮具有较好的抗张强度和撕裂强度。

3.9复合酶处理后坯革的感官性能

复合酶处理后坯革的感官性能列于表7。用眼观手摸的方法，对皮革的丰满性、柔软性、粒面紧实性、圆润性、染色性和外观等性能进行了评价。数字越大表明性能越好。结果表明，酶处理皮革紧实度较高，粒面平滑性、粒面紧实性、圆润性、染色性和强度与传统处理的皮革相当。

表7　山羊面革的感官性能

表6　头层革的强度性质（表中值表示为平均值±SD，n=3，ρ＜0.05认为显著）

图5　复合酶处理山羊皮扫描电镜显微图像（a：表面，b：横截面）

图6　蓝湿革扫描电镜显微图像（a：表面，b：横截面）

图7　山羊坯革扫描电镜显微图像（a：表面，b：横截面）

3.10扫描电镜评价复合酶对皮质的影响

使用显微技术观察了山羊皮在不同制革阶段的的形貌变化，观察了纤维取向、纤维分散、纤维束的致密性。这种方法定性地确定了复合酶在皮革生产中的作用。图5～7显示的是复合酶处理后裸皮、蓝湿革、坯革的粒面和横截面的电子扫描显微图像。从图中可以看出，酶处理后的皮表面性能没有显著变化。图6显示蓝湿革样品纤维取向均匀、规整。山羊蓝湿革样品纤维表现出非常有序和结构密实，特别是在粒面层和真皮的主要连接层之间。纤维的密实和有序主要是因为纤维束的有效分散，使铬的吸收率高。如图7所示，坯革的纤维结构更致密，整个横截面松散均匀。纤维束的有序分散使后续化料如复鞣剂、染料、加脂剂在皮中扩散更好。

3.11同步脱毛和松散纤维系统的经济可行性

应用配方复合酶（蛋白酶和淀粉酶）可有效地脱毛和去除纤维间质。新制革清洁技术的工业应用，可能从实验室规模获得较好的皮革强度开始。商业酶产品（蛋白酶活力100 U/g，淀粉酶活力1 000 U/g，用量3.5%）来自印度金奈的美国Alacrity (I)私人有限公司，所获得的皮革质量显示出了良好的前景。传统制革过程使用化学品的成本为每吨原皮约54美元，而酶处理过程花费的化料成本约为每吨原皮55美元，去掉了脱灰、软化等中间过程。本法完全不用石灰和硫化物，使污水中的硫化物含量为零，脱灰过程也省去了。传统方法软化时使用碱性蛋白酶去除短毛和脱灰后遗留的纤维间质，因此本方法也可省去软化步骤。使得制革过程中使用酶又不增加制革成本成为可能，同时酶处理过程降低了COD和TS负荷，降低了污水处理成本。本方法与传统方法比较，降低了COD。由于酶处理，使得坯革的面积大约增加了2%。本方法同时使用了蛋白酶和淀粉酶，与传统方法比较增加了得革率。按增加3%的面积计算，每吨原料皮节省570美元。传统的准备操作要处理浸灰污泥，导致经济和生态问题。总之，这些新方法有利于制革者采取生态友好的制革方法，减少污染负荷，不增加制革成本。

4　结论

本研究涉及准备工段使用酶的清洁工艺。当复合酶用量3.5%时，可达到有效的脱毛和松散纤维效果。建立了染色和热孔测量法，作为了解制革过程中纤维松散情况的工具。复合酶处理后的皮质用苏木精和曙红染色，显微图像证明纤维束分散良好、有序。孔隙尺寸分布更均匀，酶处理的裸皮孔隙尺寸10～100 nm，而传统方法处理的裸皮孔隙尺寸只有10～50 nm。一般参数如粒面平滑性、染色性、铬斑和外观可与传统灰碱法处理的裸皮媲美。复合酶处理后鞣制的蓝湿皮铬吸收率为89%，收缩温度112℃。山羊面革的抗张强度和撕裂强度分别为260 kg/cm2和43 kg/cm。坯革的力学性能符合工发组织规范，这是一种有效的皮革加工方法。其形态特征证明酶处理过程纤维分散良好，坯革纤维紧实表明铬和鞣后化学品吸收率高。环境参数受益于化学品吸收率高，降低了污染负荷。本研究直指皮革生物过程新领域，满足了鞣前操作所面临问题的解决。

（编译自：Journal of Cleaner Production，83 (2014) 428-436）