shRNA干扰MDR1基因逆转胃癌细胞多药耐药性的研究

王晓鑫，王朝阳，周　静

(1内蒙古医科大学附属医院，内蒙古 呼和浩特 010050；2内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010059)

shRNA干扰MDR1基因逆转胃癌细胞多药耐药性的研究

王晓鑫1，王朝阳1，周静2*

(1内蒙古医科大学附属医院，内蒙古 呼和浩特 010050；2内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010059)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0543)

肿瘤多药耐药性(multidrug resistance,MDR)是引起肿瘤化疗失败的重要原因之一。由MDRl基因编码的P-糖蛋白(P-glycopmtein,P-gp) 作为一种ATP依赖性药物泵,影响药物在细胞内聚集,是导致MDR最直接原因。P-gp在胃癌细胞中呈高表达，且与细胞耐药性的产生密切相关[1]。因此MDR1/P-gp可作为逆转胃癌多药耐药的靶点。本实验通过短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA) 技术沉默MDR1基因，转染胃癌耐奥沙利铂(oxaliplatin,L-OHP)细胞SGC7901/L-OHP，观察转染前后胃癌细胞对化疗药L-OHP和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)敏感性的变化，为临床胃癌化疗耐药性的逆转、提高疗效，寻找新的靶点和途径提供实验依据。

1材料与方法

1.1主要材料SGC7901细胞购自中山大学实验动物中心细胞库；质粒pGPU6/GFP/Neo、大肠杆菌DH5α、特异针对MDR1基因及非特异性阴性对照序列购自上海吉玛公司；Lipofectimane2000脂质体转染试剂盒、Trizol购自Invitrogen公司；质粒小量抽提试剂盒购自Qiagen公司；P-gp一抗和羊抗兔二抗购于Santa公司， RNA反转录试剂盒、SYBR GreenI荧光定量试剂盒购于 Gene Copoeia公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、H-DMEM和胎牛血清购自Gibco公司；L-OHP、5-FU 购自江苏恒瑞医药股份有限公司。

1.2细胞培养用含10 %胎牛血清的H-DMEM培养基培养SGC7901细胞，在37℃、5 %CO2条件下孵育，2～3 d 换液一次，常规消化传代。

1.3构建SGC7901/L-OHP耐药细胞系筛选IC90浓度L-OHP下存活的SGC7901细胞克隆，采用剂量递增法诱导产生耐药细胞[2]。在细胞传代换液时加入不同浓度的L-OHP，首次加药剂量为1.6 μg·mL-1(1/9IC50)，每周传代2 次。待细胞生长良好进入对数生长期增加0.5倍L-OHP药物浓度，最高浓度为18.2 μg·mL-1。给药4月后获得对L-OHP耐药的SGC7901细胞，命名为SGC7901/L-OHP细胞。实验检测前1w停用L-OHP处理。

1.4MTT法检测L-OHP、5-FU对SGC7901/L-OHP的细胞毒作用 收集对数生长期的SGC7901和SGC7901/L-OHP细胞， 制成细胞悬液，按1×104个·孔-1细胞接种于96 孔细胞培养板中，培养24 h后，分别加入不同浓度的L-OHP (64、32、16、8、4、2μg·mL-1)，5-FU(160、80、40、20、10 和5 μg·mL-1)，继续培养24 h。每孔加入MTT 20 μL，混匀，再培养4 h，弃上清液，每孔加入DMSO 150 μL，充分震荡后酶标仪上测570 nm 波长处吸光度值。每一浓度设5 个平行孔，重复3 次实验。以背景组调零，按以下公式计算各组细胞的存活率：细胞存活率=(OD570实验组-OD570背景组)/(OD570空白组-OD570背景组)×100% ；并计算各组IC50值和耐药倍数(resistance fold，RF)：RF =IC50(耐药细胞)/ IC50(亲本细胞)。

1.5细胞转染转染前16 h，将SGC7901/L-OHP耐药细胞以1×106·孔-1的密度接种于6 孔培养板，按照Lipofectamine TM2000 试剂盒说明书操作，将脂质体和质粒孵育形成脂质复合体，转移到细胞培养板中，6 h 后更换含10 %胎牛血清的DMEM培养液继续培养。实验分为3组：空白对照组、阴性质粒组、重组质粒组(pGPU6/GFP/Neo- MDR1组)。

1.6real-time PCR 检测MDR1 mRNA 的表达将质粒转染SGC7901/L-OHP细胞36 h后，用Trizol 试剂提取总RNA。测定各组细胞的总RNA浓度，然后反转录为cDNA。按照试剂盒的方法，进行real-time PCR 反应。β-actin 为内参，上游引物:5′-GCACCTGTAGCGCAAAGAGC-3′，下游引物:5′-GTTCATTCCCTGTAACGCCT-3′， 62 ℃退火。MDR-1 基因上游引物:5′-GATTATTCTTAAAGATCAAT-3′，下游引物:5′-TTAGAAACTTAATATTATTC-3′，58 ℃ 退火。实验重复3 次。

1.7Western blot 检测P-gp的表达免疫共沉淀裂解液提取总蛋白，进行SDS-PAGE电泳。每孔加入50 pg蛋白质，将电泳分离的蛋白条带转移至硝酸纤维素膜上，封闭过夜，加入P-gp一抗孵育2 h，PBST洗涤3 次，羊抗兔二抗孵育2 h，洗涤3 次。用Labwork4图像分析软件进行光密度积分值分析。

1.8体外药物敏感性实验实验分为3组：空白对照组、阴性质粒组、重组质粒组(pGPU6/GFP/Neo MDR1组)。将SGC7901/L-OHP细胞接种于96 孔板( 每孔1×104个细胞) ，按1.4 MTT法检测L-OHP、5-FU对pGPU6/GFP/Neo- MDR1重组质粒转染的SGC7901/L-OHP细胞的细胞毒作用，并计算IC50值。每一浓度设5 个平行孔，重复3 次实验。

2结果

2.1SGC7901/L-OHP耐药细胞系的建立采用药物浓度递增法获得了能耐受18.2μg·ml-1L-OHP生长良好的SGC7901/L-OHP耐药细胞。MTT法检测结果显示：L-OHP作用SGC7901细胞的IC50值(12.26μg·ml-1)明显低于作用SGC7901/L-OHP细胞的IC50值(74.33μg·ml-1)，差异有统计学意义(P< 0.01)，RF为6.06。本实验诱导获得的SGC7901/L-OHP细胞不仅对L-OHP耐药， 而且对5-FU也产生交叉耐药特性，RF为1.82(表1)。

2.2pGPU6/GFP/Neo- MDR1重组质粒转染SGC7901/L-OHP细胞转染24h后，空白对照组无荧光表达，阴性质粒组和pGPU6/GFP/Neo-MDR1重组质粒组均可见绿色荧光表达，转染率达90%以上(图1)。

表1　　SGC7901和SGC7901/L-OHP细胞对L-OHP和5-FU

*P<0.05，**P<0.01，vs SGC7901 group

2.3real- time PCR法检测MDR-1基因表达以β-actin为内参，与空白对照组和阴性质粒组比较，重组质粒组细胞内MDR1 mRNA表达水平显著下调[(23.019±0.084)%]，与空白对照组[(89.649±0.052)%]和阴性质粒组[(85.701±0.075)%]比较，差异有统计学意义(P<0.01)。结果表明pG-PU6/GFP/Neo- MDR1重组质粒转染SGC7901/L-OHP细胞后MDR1基因被稳定抑制，成功沉默SGC7901/L-OHP细胞株的MDR1基因。

A:negative plasmid group; B:recombinant plasmid group(×100)

2.4Western blot检测P-gp蛋白的表达重组质粒组P-gp蛋白表达受抑制(0.366±0.025)，明显低于空白对照组(0.679±0.027)和阴性质粒组(0.692±0.024)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

A:control group; B:recombinant plasmid group;C:negative

plasmid group

图2P-gp蛋白表达

2.5沉默MDR1后的SGC7901/L-OHP药物敏感性实验pGPU6/GFP/Neo- MDR1重组质粒转染SGC7901/L-OHP细胞后，用MTT法检测L-OHP、5-FU对SGC7901/L-OHP的IC50。结果显示，沉默MDR1基因后，耐药细胞SGC7901/L-OHP与阴性质粒组和空白对照组相比不仅对L-OHP的IC50明显下降，而且对5-FU的IC50也降低，差异有显著性(P<0.05)。说明沉默MDR1可以改善胃癌细胞的多药耐药性，增加细胞对L-OHP和5-FU的敏感性(表2)。

表2　shRNA干扰MDR1基因表达后 SGC7901/L-OHP

*P<0.05，vs control group

3讨论

目前，化疗是胃癌的最主要治疗措施，但肿瘤细胞对化疗药物产生耐药现象尤其是多药耐药，往往导致化疗失败。肿瘤多药耐药是指对某一种药物产生耐药性的同时，肿瘤细胞对结构不同、细胞作用靶点不同的多种化疗药物产生交叉性耐药[3]。MDR的产生严重影响了肿瘤的化疗效果[4]。MDR1 基因编码P-gp蛋白的过表达，在临床化疗耐药中发挥显著作用，尤其是实体肿瘤和血液系统恶性肿瘤，包括消化道肿瘤：结肠癌、胃癌等。P-gp 蛋白是一种ATP 依赖性药物跨膜外流泵，与化疗药结合后能依赖ATP 供能将疏水性药物泵出细胞外，使细胞内药物有效浓度下降，造成耐药现象[5,6]。因此逆转P-gp介导的多药耐药策略成为克服肿瘤多药耐药的最直接的方法[7,8]。目前已开发了以P-gp为靶点的三代抑制剂(维拉帕米，环孢素A类似物，多非喹达，米托坦等)抑制P-gp的表达或者功能，但是它的II /III 期临床试验并没有取得满意的效果，限制了其广泛的应用[9]。RNA干扰技术是近年来发展起来的一项新的基因沉默技术，用与靶基因序列同源的双链RNA诱导，沉默细胞内同源mRNA的表达，而不影响其他基因的mRNA表达，达到特异性剔除或关闭特定基因表达的效果，表现为转录后的基因沉默[10]。RNA干扰技术已被广泛用于探讨基因功能和恶性肿瘤的基因治疗领域。其中shRNA技术与传统RNA干扰技术相比具有特异性强、容易转染、表达丰度高的特点[11]。因此本实验通过shRNA技术干扰胃癌耐药细胞株SGC7901/L-OHP中MDR1基因的表达，观察转染后耐药细胞株对L-OHP和5-FU耐药性的逆转作用。

L-OHP是铂类化疗药的一种，通过与DNA链的碱基形成交叉联结而破坏DNA的结构和功能。L-OHP是临床治疗胃癌的一线化疗药和术后辅助化疗药。但L-OHP在临床广泛应用的同时，也产生了肿瘤耐药的严重问题，导致化疗的失败。本研究以L-OHP为诱导剂，采用逐渐增加L-OHP浓度诱导建立人胃癌细胞SGC7901/L-OHPL-OHP耐药模型。MTT结果显示L-OHP 对SGC7901/L-OHP细胞作用的IC50值比SGC7901细胞明显升高，RF为6.06，而且对5-FU也表现一定的耐药性。5-FU常与L-OHP联合组成DF方案用于胃癌的常规化疗。按照RF<5认为是低度耐药，RF为5～15中度耐药，RF>15高度耐药[12]。SGC7901/ L-OHP细胞对L-OHP属于中度耐药，对5-FU具有低度耐药，证实SGC7901/ L-OHP具有多药耐药细胞系的特征。

pGPU6/GFP/Neo- MDR1重组质粒稳定转染SGC7901/ L-OHP后，经real-time PCR 和Western blot 检测，SGC7901/L-OHP细胞中MDR1 基因的表达显著降低(P<0.01) ，MDR1基因的表达产物P-gp的表达下降(P<0.05)。说明shRNA技术能高效、特异性地阻断特定基因的表达，使目标基因MDR1的同源mRNA降解，减少特异蛋白P-gp的表达，最终实现功能的抑制。细胞药敏试验表明干扰MDR1基因可有效逆转SGC7901/ L-OHP细胞耐药性，使胃癌细胞对L-OHP和5-FU敏感性提高。以上结果均提示shRNA技术沉默MDR1基因可有效逆转胃癌细胞的多药耐药，MDR1基因是逆转肿瘤耐药的有效靶点。

参考文献：

[1]Rui H,Ana IO,Vera LC,et al.Epigenetic regulation of MDR1 gene through post-translational histone modifications in prostate cancer[J].BMC Genomics,2013,14:898.

[2]石凤芹,许亚梅,饶恩于,等.miR-17-92 对急性白血病L1210/DDP 细胞多药耐药性影响研究[J].现代生物医学进展,2013,13:1449.

[3] Hida K,Akiyama K,Ohga N,et al.Tumour endothelial cells acquire drug resistance in a tumour microenvironment[J].Biochem,2013,153:243.

[4]Y Mi,L Lou.Reply:ZD6474 reverses multidrug resistance by directly inhibiting the function of P-glycoprotein[J].Br J Cancer,2007,97:1715.

[5] Fuqlang S,Xiaoming L,Hang L,et al.Special AT-rich sequence binding protein 1 regulates the multidrug resistance and invasion of human gastric cancer cells[J].Oncol Lett,2012,4:156.

[6] Daniel C,Bell C,Burton C,et al.The role of proton dynamics in the development and maintenance of multidrug resistance in cancer[J].Biochimica et Biophysica Acta,2013,1:606.

[7]杜惠惠,任强,刘晓民.P-糖蛋白介导的肿瘤多药耐药机制及其逆转策略[J].中华肺部疾病杂志(电子版),2013，6(6):551.

[8] Freya K,Poongavanam V,Gerhard F.Ligand and Structure-Based Classification Models for Prediction of P-Glycoprotein Inhibitors[J].J Chem Inf Model,2014，54(1):218.

[9] Se-Kyoung L,Adeeb S,Jae-Chang J,et al.Protein Kinase Cα Protects Against Multidrug Resistance in Human Colon Cancer Cells[J].Mol Cells,2012,34:61.

[10]李乾,江杰炜,张生烈,等.逆转肿瘤耐药的P-糖蛋白抑制剂研发新策略[J].药学进展,2013,37:313.

[11] Jeffrey L,Min Zh,Ya lT,et al.MicroRNAs,an active and versatile group in cancers[J].Int J Oral Sci,2011,3:165.

[12]张南文,许建华.人结肠癌耐药细胞系SW480/L-OHP的建立及其耐药机制初探[J].福建医科大学学报,2013,47：228.

摘要：目的利用短发夹RNA (short hairpin RNA,shRNA) 技术沉默多药耐药基因1(multidrug resistance,MDR1)，探讨其对SGC7901/ L-OHP细胞株多药耐药性的逆转作用。方法采用逐步增加药物浓度法建立耐奥沙利铂(oxaliplatin,L-OHP)的胃癌细胞株SGC7901/L-OHP，用shRNA技术沉默MDR1基因在SGC7901/ L-OHP细胞中的表达，以real-time PCR 检测细胞中MDR1 mRNA 的表达，Western blot 检测细胞中P糖蛋白(P-glycopmtein,P-gp)的表达，MTT法检测转染后SGC7901/L-OHP细胞对L-OHP和5-FU的敏感性。结果shRNA沉默SGC7901/ L-OHP细胞株MDR1基因后，与空白组和阴性质粒组比较，MDR1 mRNA表达抑制(P<0.01)，且P-gp表达下调(P<0.05)。干扰后的SGC7901/L-OHP细胞对L-OHP和5-FU的敏感性显著升高(P<0.05)。结论shRNA可有效沉默SGC7901/ L-OHP胃癌耐药细胞株MDR1基因的表达，提高耐药的胃癌细胞对化疗药的敏感性。

关键词：胃癌；多药耐药；shRNA

Reversion of multidrug resistance in gastric cancer cell by shRNA targeting MDR1 geneWANGXiao-xin1,WANGZhao-yang1,ZHOUJing2.(1.AffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity，Hohhot010050，China;2.InnerMongoliaMedicalUniversity，Hohhot010110，China)

Abstract:ObjectiveTo silence the expression of multidrug resistance (MDR1) gene in SGC7901/ L-OHP cell line by using short hairpin RNA (shRNA) in order to reverse its resistance to MDR1.MethodsA human drug-resistance gastric cancer cell line,SGC7901/L-OHP,was generated by continuous exposure to gradually increasing concentrations of L-OHP. MDR1 gene expression in SGC7901/ L-OHP cells was inhibited by using shRNA. The expression of MDR1 mRNA in SGC7901/ L-OHP cells was assayed by real-time PCR. The P-gp protein expression was determined by Western blot analysis. The sensitivity to L-OHP and 5-FU was measured by MTT assay in SGC7901/ L-OHP cells after shRNA. ResultsCompared with the control group and negative plasmid group,the expression of MDR1 mRNA and P- gp were reduced obviously after silencing the expression of MDR1 gene in SGC7901/ L-OHP cell line by using shRNA (P<0.01,P<0.05). The sensitivity of SGC7901/L-OHP cells to L-OHP and 5-FU increased significantly after the interference (P<0.05). Conclusion shRNA can effectively inhibit the expression of MDR1 gene in SGC7901/L-OHP cell line and improve the sensitivity of gastric cancer cells to chemotherapy drugs.

Key words:Gastric cancer; Multidrug resistance; short hairpin RNA

收稿日期：(2014-02-21)

文献标识码：A

中图分类号：R735.2

通讯作者*

基金项目：内蒙古医科大学博士启动基金(BSJJ2013,BSJJ2012)；内蒙古自治区高等学校科学研究项目(NJZY14132)