磷酸化Smad3在神经元样细胞氧糖剥夺中的表达变化

徐仲航,王一鸣,王勇涛,王姣琦,何金婷,莽　靖*,邵延坤* ,徐忠信

(1.吉林大学白求恩医学部临床医学院，吉林 长春130021；2.吉林大学中日联谊医院 神经内科，吉林 长春130033)

磷酸化Smad3在神经元样细胞氧糖剥夺中的表达变化

徐仲航1,王一鸣1,王勇涛1,王姣琦2,何金婷2,莽靖2*,邵延坤2*,徐忠信2

(1.吉林大学白求恩医学部临床医学院，吉林 长春130021；2.吉林大学中日联谊医院 神经内科，吉林 长春130033)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0523)

研究发现，激活素A(ActivinA，ActA)作为转化生长因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)超家族的成员之一，主要通过ActA/Smads 信号转导通路在缺血性脑损伤中发挥神经保护作用[1,2]。本研究利用PC12 神经元样细胞OGD模型体外模拟神经细胞缺血性损伤[3]，动态检测OGD不同时间磷酸化Smad3蛋白表达变化，以期明确脑缺血损伤中ActA/Smads通路细胞内信号转导模式。

1材料和方法

1.1　主要材料

大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞购自北京金紫晶生物医药技术有限公司。兔抗大鼠磷酸化Smad3抗体购自美国ThermoFisher公司，小鼠抗大鼠β-actin抗体购自美国Santa公司，兔抗大鼠NSE抗体，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗，FITC标记的羊抗兔IgG二抗购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2　 实验方法

1.2.1PC12细胞培养使用含10%马血清，10%胎牛血清的高糖DMEM培养液于37℃含5%CO2饱和湿度的培养箱中培养PC12细胞。培养液每2-3天更换一次，细胞接近80%融合时用0.25%胰酶进行常规消化传代。

1.2.2神经元样PC12细胞的诱导及鉴定采用本研究前期实验方法，应用NGF诱导PC12细胞为神经元样细胞并采用NSE免疫荧光染色进行鉴定。

1.2.3神经元样细胞OGD模型建立采用本研究前期实验方法，应用终浓度为1.0 mmol/L Na2S2O4无糖DMEM培养液建立神经元样细胞体外OGD模型。

1.2.4MTT细胞存活率检测将PC12细胞以1×104/孔接种于96孔细胞培养板，次日细胞贴壁后分别用OGD处理0、3、6、12 h。随后轻轻吸除无糖DMEM培养液，再加入含10 μl 5 mg/ml MTT的正常培养液，37℃孵育4 h后弃去培养液，加入100 μl二甲基亚砜溶解蓝紫色结晶，振荡溶解后使用酶标仪在490 nm处测定吸光度(A)，每组细胞测定4复孔。实验重复三次，根据测定的每组细胞吸光度值(A)与OGD 0 h的吸光度值(A)进行比较，计算各组细胞的存活率，公式如下：

细胞存活率(%)=

1.2.5Western blot磷酸化Smad3蛋白水平的表达检测使用RIPA裂解液分别提取上述四组细胞的总蛋白，BCA法测定蛋白浓度以调整上样量。经SDS-PAGE电泳、转膜、封闭后将 PVDF 膜放入杂交袋中，分别用兔抗大鼠磷酸化Smad3(p-Smad3)(1∶500)和小鼠抗大鼠β-actin(1∶1000)4℃ 孵育过夜。次日TBST洗膜后用辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠或羊抗兔二抗(1∶1000)室温孵育1 h后ECL显影压胶片。凝胶图像分析系统扫描胶片，ImageJ软件灰度分析后通过计算目的条带与其对应的内参条带的比值来表示目的蛋白的表达水平。

1.3　统计学分析

2结果

2.1　NSE免疫荧光染色

正常的PC12细胞为圆形，呈半悬浮状态，容易聚集成团，经NGF诱导分化的神经元样PC12细胞呈星形并带有较长突起，NSE免疫荧光染色后激光共聚焦观察，在蓝色激发光下呈现绿色荧光的胞体为高表达NSE，紫色激发光下可见呈蓝色荧光的复

染细胞核，表明NGF诱导分化的PC12细胞NSE高表达。

2.2　细胞存活率检测

经OGD处理3h后PC12细胞的存活率显著降低，为63.7%，与OGD0h相比差异有统计学意义(P<0.05)，至OGD12h，其存活率降为54.7%，说明OGD可成功模拟神经细胞缺血性损伤，见图1。

*与OGD0 h比较P<0.05

2.3　磷酸化Smad3蛋白检测

OGD处理3h后磷酸化Smad3的表达较OGD0h时升高，至OGD12h时明显降低(图2)。

图2　磷酸化Smad3蛋白检测

3讨论

近期研究发现，ActA作为一种神经营养因子，在中枢神经系统内存在表达，并在脑组织缺血缺氧性损伤中发挥着早期神经保护功能[4,5]。作为第一信使，激活的ActA首先与细胞膜TGF-βII型受体结合，磷酸化激活TGF-βI型受体，继而募集活化下游R-Smads。在ActA/Smads信号通路中磷酸化Smad2/3与Smads锚着蛋白(Smadanchorforreceptoractivation,SARA)分离，并与Smad4形成Smad2/4和Smad3/4复合物。上述异二聚体进而转入细胞核与DNA结合，调控靶基因表达，并完成ActA/Smads通路的跨膜信号转导[6,7]。通常认为，在这一信号转导过程中，虽然Smad2与Smad3为两种不同蛋白，但其作用相同。在缺血性脑损伤中，有研究发现存在Smad2磷酸化水平的升高，但作为ActA/Smads信号通路发挥生物学功能的关键位点，Smad3的表达变化尚不清楚。

本研究利用OGD模型体外模拟神经细胞缺血性损伤，经MTT验证模型成功后检测磷酸化Smad3在OGD各时间点的表达情况。结果发现在OGD早期即OGD3h时即发生磷酸化Smad3表达升高，并持续至OGD6h，到OGD12h降低，研究结果一方面再次证实了缺血性脑损伤可诱导细胞内的Smads途径激活，这与本课题前期研究和国外其他研究结论一致[1,2]；另一方面，也证实了Smad2与Smad3在ActA/Smads信号通路的激活过程中所起的作用是一致，细胞内磷酸化Smad3表达水平可作为ActA/Smads通路早期活化过程的标志。进一步针对其核内调控位点的研究将为神经细胞缺血性损伤后ActA/Smads通路的神经保护机制及缺血性脑损伤的治疗提供新的启示。

参考文献：

[1]MukerjiSS,KatsmanEA,WilberC,etal.Activinisaneuronalsurvivalfactorthatisrapidlyincreasedaftertransientcerebralischemiaandhypoxiainmice[J].JCerebBloodFlowMetab,2007,27(6):1161.

[2]MangJ,MeiC-L,WangJ-Q,etal.EndogenousProtectionDerivedfromActivinA/SmadsTransductionLoopStimulatedviaIschemicInjuryinPC12Cells[J].Molecules,2013,18(10):12977.

[3]LiCT,ZhangWP,LuYB,etal.Oxygen-glucosedeprivationactivates5-lipoxygenasemediatedbyoxidativestressthroughthep38mitogen-activatedproteinkinasepathwayinPC12cells[J].JNeurosciRes,2009,87(4):991.

[4]WangJQ,HeJT,DuZW,etal.EffectsofSARAonoxygen-glucosedeprivationinPC12cellline[J].NeurochemRes,2013,38(5):961.

[5]HeJin-Ting,MangJing,MeiChun-Li,etal.NeuroprotectiveEffectsofExogenousActivinAonOxygen-GlucoseDeprivationinPC12Cells[J].Molecules,2011,17(1):315.

[6]ShiY,MassagueJ.MechanismsofTGF-betasignalingfromcellmembranetothenucleus[J].Cell,2003,113(6):685.

[7]SchmiererB,HillCS.TGFbeta-SMADsignaltransduction:molecularspecificityandfunctionalflexibility[J].NatRevMolCellBiol,2007,8(12):970.

摘要：目的探讨磷酸化Smad3蛋白在神经元样PC12细胞氧糖剥夺中的表达变化。方法利用鼠神经生长因子(NGF)诱导大鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12)向神经元样细胞转化，应用无糖DMEM培养液联合连二亚硫酸钠(Na2S2O4)构建氧糖剥夺模型(oxygen-glucose deprivation，OGD)，体外模拟神经元缺血性损伤。MTT检测神经元样细胞OGD 0，3，6和12 h存活率，Western blot检测OGD 前后磷酸化Smad3蛋白表达。结果成功建立神经元样PC12细胞的OGD模型；OGD 3 h后细胞存活率显著下降，至OGD 12 h降至最低54.7%；细胞内磷酸化Smad3表达在OGD 3、6 h与OGD 0 h组相比略升高，至OGD 12 h时明显降低。结论磷酸化Smad3参与在神经元样细胞OGD早期ActA/Smads通路的活化。

关键词：ActA/Smads；磷酸化Smad3；OGD

Changes of Smads mRNA in nerve-like cells after OGD injuryXUZhong-hang,WANGYi-ming,WANGYong-tao,etal. (NormanBethuneHealthCenterofJilinUniversity,Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveTo explore changes of phosphorylated Smad3(p-smad3) expression in neuron-like PC12 cells after oxygen-glucose deprivation(OGD).MethodsRat nerve growth factor (NGF) was used to induce the differentiation of rattus PC12 pheochromocytoma cells to neuron-like cells.Na2S2O4 and glucose-free DMEM were introduced to perform an OGD model.The survival rate of cells suffered by OGD was examined by MTT assay.And the protein expression of p-smad3 measured by Western blot.ResultsPC12 cells were successfully differentiated into neuron-like cells after NGF exposure.The survival rate of cells were dramatically decreased after 3h of OGD exposure,and reached to its lowest point at 12h.Compared with OGD 0h,expression of p-Smad3 was slightly increased after 3 or 6 h,and significantly decreased at 12h.Conclusionp-Smad3 took part in the activation of ActA/Smads signaling in response to early time of OGD treatment.

Key words:ActA/Smads；phosphorylated Smad3；OGD

收稿日期：(2014-08-30)

文献标识码：A

中图分类号：R743.3

文章编号：1007-4287(2015)04-0523-03

通讯作者*

基金项目：国家自然基金面上项目(81371298);吉林省科技发展计划国际合作项目(20120723);吉林省产业技术研究与开发项目(2013C030-4);吉林大学大学生国家级创新基金项目(2014A79339)