芪竭乳没胶囊对载脂蛋白E基因敲除小鼠血脂及炎症反应的影响

史　琦，胡元会，李友林，吴华芹，禇瑜光，齐连芬

芪竭乳没胶囊对载脂蛋白E基因敲除小鼠血脂及炎症反应的影响

史琦1，胡元会2，李友林1，吴华芹2，禇瑜光2，齐连芬2

摘要：目的观察芪竭乳没胶囊对载脂蛋白E基因敲除小鼠血脂及炎症反应的影响。方法8周龄ApoE-/-小鼠高脂饲料喂养，芪竭乳没胶囊连续灌胃30 d后，酶法及选择性沉淀法测定血清血脂含量，免疫组化染色法测定主动脉内膜及动脉粥样硬化(AS)斑块内肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达。结果芪竭乳没胶囊大、小剂量组小鼠血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平较模型组明显降低(P<0.05或P<0.01)；芪竭乳没胶囊大、小剂量组小鼠主动脉内膜及AS斑块内TNF-α的表达与模型组比较明显减少，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论芪竭乳没胶囊能明显降低ApoE-/-小鼠血清TC、TG及LDL-C，抑制ApoE-/-小鼠主动脉内膜、AS斑块内TNF-α的表达，通过抑制炎症因子的产生发挥其阻止AS发生发展的作用。

关键词：动脉粥样硬化；载脂蛋白E基因敲除小鼠；芪竭乳没胶囊；血脂；炎症反应

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是发生在大、中血管的一种慢性特异性炎症，脂质代谢紊乱是导致AS发病的主要机制之一，而易损斑块的破裂合并血栓形成是造成心血管急性临床事件的重要病理基础[1]。中医药在动脉粥样硬化的预防和治疗中显示出举足轻重的作用，特别是随着毒邪学说研究的不断深入，动脉粥样硬化从痰瘀毒论治已成为值得深入研究的重要课题，但是从“益气托毒”的角度探讨并治疗动脉粥样硬化的报道较少见。以往文献报道中认为黄芪、血竭、乳香和没药具有良好的降脂和抗动脉粥样硬化作用[2-4]。本研究进一步分析益气托毒中药的有效成分对载脂蛋白E(ApoE)基因缺陷小鼠动脉粥样硬化的干预作用，并探讨其可能的作用机制。

作者单位：1.中日友好医院(北京 100029)；2.中国中医科学院广安门医院

1材料与方法

1.1实验动物8周龄载脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE-/-小鼠)33只，由北京大学医学部实验动物科学部提供，雄性，体重20 g～27 g，正常C57BL/6小鼠11只。ApoE-/-小鼠饲以“西方类型膳食”饲料，胆固醇含量0.15%，脂肪含量21%；普通二级清洁饲料喂养正常C57BL/6小鼠。国家二级标准饲养条件，室温22 ℃～24 ℃，相对湿度50%，光照时间07：00～19：00，自由进食、进水。

1.2药品及试剂芪竭乳没胶囊由黄芪多糖、血竭黄酮、乳香油、没药油按照一定比例组成，购自陕西森弗生物技术有限公司，产品批号黄芪多糖：20060201，血竭黄酮：20070306，乳香油、没药油：20060802。0.9%氯化钠注射液，双鹤制药股份有限公司，生产批号：0506042。SABC免疫组化染色试剂盒、一抗兔抗鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)抗体，武汉博士德生物工程有限公司；总胆固醇(TC)试剂盒、三酰甘油(TG)试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒，北京北化康泰临床试剂有限公司。

1.3主要仪器设备IX-70荧光倒置显微镜(日本 OLYMPUS)；RM2135石蜡切片机(德国 LEICA)；亚鹏CS-Ⅲ生物组织摊片烤片机(湖北省医用电子仪器厂)；VANOX显微照相系统(日本 OLYMPUS)；图像分析软件(美国 Image-Pro Plus Version 4.5.1)。

1.4方法

1.4.1分组及给药将ApoE-/-小鼠随机分为模型组、芪竭乳没胶囊大剂量组、芪竭乳没胶囊小剂量组，每组11只；C57BL/6小鼠11只为正常组。芪竭乳没胶囊的剂量根据以往实验研究中的平均灌胃剂量，同时结合临床中用药习惯，黄芪多糖1 g/kg～2 g/kg，血竭黄酮200 mg/kg～400 mg/kg，乳香油、没药油150 mg/kg～300 mg/kg，均以0.9%氯化钠注射液溶解后灌胃，剂量为0.1 mL/10 g体重，每日1次。正常组和模型组予以等量0.9%氯化钠注射液灌胃。44只小鼠均连续灌胃30 d。

1.4.2标本取材取材前夜禁食禁水，次日采用眼球摘除取血法处死，每只小鼠取血不少于0.8 mL。血样静置2 h后高速离心(3 000 r/min)，分离上层血清。迅速剪开胸腔暴露心脏，直视下取出心脏及主动脉，从主动脉根部取至主动脉弓，剥离血管外附着组织，生理盐水冲洗，4%甲醛溶液固定保存。

1.4.3检测指标及测定方法TC、TG以酶法测定，LDL-C用选择性沉淀法测定。每组随机选取6只小鼠的心脏及主动脉标本，应用德国LEICA石蜡切片机制备连续切片，从冠状动脉与主动脉的开口处连续切至心尖，每只小鼠切片50张，每张切片2个组织面，每张切片厚5 μm，间隔6张取1张。采用抗生物素蛋白-生物素-氧化物酶复合体法(ABC法)检测主动脉根部动脉粥样斑块内及主动脉内膜TNF-α的表达，抗体稀释度均为1∶200。光镜下观察免疫组化切片，黄褐色颗粒为阳性表达。×100倍光镜下，每张切片取5个视野，IPP图像分析软件统计阳性表达光密度值(IOD)。

2结果

2.1芪竭乳没胶囊对ApoE-/-小鼠血脂的影响(见表1)ApoE基因缺陷小鼠饲以“西方类型膳食”30 d后，模型组血清TC、TG、LDL-C水平较正常组明显升高(P<0.01)。芪竭乳没胶囊大、小剂量组小鼠血清TC、TG及LDL-C含量较模型组明显降低(P<0.05或P<0.01)，特别是降低血清TG及TC的作用更加明显，芪竭乳滑胶囊大、小剂量组的降脂作用差异无统计学意义(P>0.05)。

表1　芪竭乳没胶囊对ApoE-/-小鼠血脂的影响(±s) 　mmol/L

2.2芪竭乳没胶囊对ApoE-/-小鼠主动脉内膜及斑块内TNF-α表达的影响芪竭乳没胶囊大、小剂量组小鼠主动脉内膜TNF-α阳性表达光密度值与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。ApoE-/-小鼠主动脉根部AS斑块内脂质中心细胞坏死区、泡沫细胞和成纤维细胞内均可见明显的TNF-α表达。灌胃30 d后，芪竭乳没胶囊大、小剂量组AS斑块内TNF-α的表达有不同程度的降低，与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。详见表2、图1。

表2　芪竭乳没胶囊对ApoE-/-小鼠主动脉内膜及

注：A 为正常组；B、E、F 为模型组；C、G 为芪竭乳没胶囊大剂量组；D、H 为芪竭乳没胶囊小剂量组。

图1各组小鼠主动脉内膜及斑块内TNF-α的表达

3讨论

随着AS研究的不断深入，很多学者认同痰浊、瘀血、热毒均与AS的发生发展密切相关，且三者并非孤立存在。津血同源，痰瘀相关，痰瘀互结，郁久腐化，渐则凝聚成毒，从而形成痰瘀毒相互胶结的病理局面[5]。实验之初，通过对比外科“疮疡”和动脉粥样硬化的病因病机，发现两者从发病机制到治疗原则均存在相似之处，因此考虑以外科常用之“托毒法”应用于AS的治疗，并在“补气活血，去腐生肌”治疗原则下，选取具有“益气托毒”作用的黄芪、血竭、乳香和没药作为实验用药。

脂质代谢紊乱是导致AS发病的主要机制之一。降脂治疗可通过减少斑块内脂质沉积，促进胆固醇的逆向转运，减少斑块内胆固醇酯浓度，增加斑块稳定性[6]。吴勇[7]证实了黄芪多糖(APS)对糖尿病大鼠微血管病变的影响以及对糖尿病高血脂具有治疗作用。研究发现：乳香油、没药油树脂部分能降低血胆固醇，防止动脉内膜粥样斑块的形成[8]。卢文田[4]用血竭胶囊治疗缺血性心脏病，在常规治疗的基础上加用血竭胶囊，症状改善快，降脂作用好。此次实验以芪竭乳没胶囊干预ApoE-/-小鼠的动脉粥样硬化过程，结果显示：芪竭乳没胶囊对AS小鼠血清TC、TG、LDL-C水平有不同程度的降低作用，尤其以降低TG和TC水平更为明显。

炎症是动脉粥样硬化的形成机制之一，也是易损斑块的重要特征。TNF-α是一种多功能细胞因子，具有多种生物活性，不仅具有抗肿瘤、参与免疫调节、影响脂质和糖代谢过程、参与机体损伤病理生理过程，而且能介导白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、前列环素等多种炎症介质的产生，是具有广泛影响的有效的促炎症性细胞因子。其存在于AS的损伤部位，介导和放大了许多相互作用，导致炎症发展、斑块不稳定和促血栓形成倾向[9]。此外，TNF-α还可活化内皮细胞，引起细胞坏死、氧化应激、血小板聚集，血栓形成，诱发ACS发生[10]。Anwar等[9]研究发现TNF-α在急性和慢性冠脉综合征中通过降低血管平滑肌细胞的活性而促进斑块的不稳定进而出现破裂。

本实验观察了ApoE-/-小鼠主动脉内膜及AS斑块内的表达情况，结果显示芪竭乳没胶囊可以显著降低ApoE-/-小鼠主动脉内膜及AS斑块内TNF-α的表达，表明芪竭乳没胶囊可以通过抑制炎症反应从而发挥阻止动脉粥样硬化发生发展及稳定斑块的作用。

参考文献：

[1]Naghavi M，Libby P，Falk E，et al.From vulnerable plaque to vulnerable patient：a call for new definitions and risk assessment strategies[J].Circulation，2003，108(14)：1664-1672.

[2]周俊琴，夏先明，薛志权，等.丹参黄芪配伍对家兔低密度脂蛋白受体的影响[J].中药药理与临床，2004，20(5)：5-7.

[3]叶建红.对药乳香没药的药理作用与临床应用体会[J].安徽中医临床杂志，2003，15(3)：264-265.

[4]卢文田.血竭胶囊治疗缺血性心脏病45例观察[J].临床荟萃，2001，16(12)：562.

[5]于俊生，王砚琳.痰瘀毒相关论[J].山东中医杂志，2000，19(6)：323.

[6]Tailleux A，Duriez P，Fruchart JC，et al.Apolipoprotein A-Ⅱ，HDL metabolism and atherosclerosis[J].Atherosclerosis，2002，164(1)：1-13.

[7]吴勇.黄芪多糖对糖尿病大鼠微血管病变的作用及机制的研究[J].湖北中医学院学报，2001，9(3)：16.

[8]郑杭生，冯年平，陈佳，等.乳香没药的提取工艺及其提取物的镇痛作用[J].中成药，2004，26(11)：956-958.

[9]Anwar A，Zahid AA，Scheidgegger KJ，et al.Tumor necrosis factor alpha regulates insulin-like growth factor-1 and insulin-like growth factor-3 expression in vascular smooth muscle[J].Circulation，2002，105：1220-1225.

[10]Schwartz SM， Hatsukami TS，Yuan C.Molecular markers，fibrous cap rupture，and the vulnerable plaque new experimental opportunities[J].Circ Res，2001，89(6)：471-473.

(本文编辑郭怀印)

Effects of Qijie Rumo Capsule on Blood Lipid and Inflammatory Response in Apolipoprotein E-knockout Mice

Shi Qi，Hu Yuanhui，Li Youlin，Wu Huaqin，Chu Yuguang，Qi Lianfen

China-Japan Friendship Hospital，Beijing 100029，China

Corresponding Author：Hu Yuanhui(Guang’anmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100053，China)

Abstract：ObjectiveTo observe the effect of Qijie Rumo capsule(QRC) on blood lipid and inflammatory response in apolipoprotein E-knockout (ApoE-/-) mice.MethodsEight weeks old ApoE-/- mice were fed with high-fat diet and after 30 days continuous intragastric administration，detected lipids by enzymic and selective precipitation methods.Meanwhile，the aortas and hearts tissue were taken for immunohistochemistry stain in order to measure the expression of tumor necrosis factor (TNF)-α in aortal intima and plaque.ResultsThe levels of total cholesterol(TC)，triglyceride(TG) and low density lipoprotein (LDL-C) in QRC high- and low-dose groups were lower than that in model group(P<0.05 or P<0.01).The immunohistochemistry stain shows that compared with model group，the expression of TNF-α in QRC groups had reduced by different degree (P<0.05 or P<0.01).ConclusionQRC can reduce the lipid levels，restrain the expression of TNF-α in ApoE-/- mice.It can relieve the atherosclerosis (AS) lesions by the means of inhibiting the produce of inflammatory factors.

Key words：atherosclerosis；apolipoprotein E-knockout mice；Qijie Rumo capsule；blood lipid；inflammatory response

(收稿日期：2015-08-05)

通讯作者：胡元会， E-mail：huiyuhui@yahoo.com.cn

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2015．18．009

文章编号：1672-1349(2015)18-2057-03

·基础医学论著/研究·