氨溴索对小鼠铜绿假单胞菌肺部感染的作用以及对肺组织表达肺泡表面活性物质相关蛋白的影响

杨　青　王桂芳　赵　虎



·论著·

氨溴索对小鼠铜绿假单胞菌肺部感染的作用以及对肺组织表达肺泡表面活性物质相关蛋白的影响

杨青1王桂芳2赵虎2

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa, PA)是医院获得性肺炎的常见病原之一，尤其多见于慢性疾病患者或免疫力低下者。近年来临床分离的PA耐药率逐渐升高，其导致的感染在临床上具有病死率高、住院时间长、经济负担重等特点，临床上常规抗菌药物治疗效果欠佳[1-2]，因此探寻新的方法协同治疗PA感染具有积极的临床意义。

盐酸氨溴索是临床常用祛痰药，除具有粘液溶解作用外，其抗氧化、抗炎、促进肺泡表面活性物质合成等作用也受到广泛研究和关注，并有研究显示其对多种肺疾病与损伤具保护作用[3]。基于大鼠内毒素性肺损伤模型和PA急性肺模型的研究显示，氨溴索预给药可降低肺泡灌洗液中多种炎症因子浓度[4-5]，氨溴索治疗可减轻大鼠肺组织水肿，促进肺泡表面活性物质(pulmonary surfactant, PS)合成[6]。以上研究结果提示氨溴索对于内毒素、PA所致急性肺损伤、肺炎具有保护作用，但其具体机制仍未明确。有研究提示氨溴索能促进百草枯中毒大鼠肺组织中肺泡表面活性物质-A(surfactant protein-A, SP-A)合成及分泌，但氨溴索对SP合成分泌的影响体内外结果仍不一致[7-8]。

本研究设想盐酸氨溴索预给药可能对PA急性感染具有保护作用，且该作用与其对肺组织表达SP的影响有关。本研究通过建立小鼠急性PA肺炎模型，测定外周血中白介素-6(interleukin-6, IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor-α，TNF-ɑ)浓度，肺组织苏术精-伊红(HE)染色病理检查及肺组织SP-A、SP-D mRNA浓度测定，旨在研究盐酸氨溴索预给药对PA肺部感染的保护作用及对SP表达的影响，为临床上应用盐酸氨溴索协同治疗PA急性肺部感染提供理论依据。

材料与方法

一、实验材料

健康雄性BALB/c小鼠42只，体质量15～23 g，购自复旦大学实验动物中心，随机分为三组：①对照组(0组)6只；②铜绿假单胞菌组(A组，感染组)18只；③铜绿假单胞菌+氨溴索组(B组，保护组)18只。A组及B组再各随机分为2、4、8 h三个时间亚组，每亚组6只。

铜绿假单胞菌标准菌株(PAO1)由复旦大学附属中山医院呼吸科提供；分光光度计比浊法调整PBS悬浊液浓度为2×108CFU/ml。注射用盐酸氨溴索，沈阳新马药业有限公司生产，规格30 mg/支。小鼠IL-6及TNF-α测定试剂盒采用小鼠IL-6 ELISA试剂盒(Diaclone)和小鼠TNF-α ELISA试剂盒(Diaclone)。PCR试剂及反应体系：cDNA逆转录试剂盒采用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Dalian, China)。反应体系采用TRizol Reagent (TianGen, DP405, Beijin, China)。免疫组织化学染色SP-A抗体：ab115791，abcam公司，USA。

二、模型建立

0组小鼠不进行处理。A组小鼠，酒精消毒颈部皮肤，颈部正中约4 mm纵行切口，钝性分离颈部肌肉筋膜暴露气管，气管内注射铜绿假单胞菌PBS悬浊液100 μl，轻柔晃动小鼠使菌液分布均匀。B组小鼠腹腔注射氨溴索(20 mg/kg，生理盐水稀释)，注射后1 h按上述方法气管内注入铜绿假单胞菌悬浊液。

0组小鼠即刻，A、B组小鼠分别按亚组时间(2 h，4 h，8 h)眼眶取血处死，血液以离心半径8 cm，1 500 r/min离心5 min，上清-20 ℃冰箱保存备用。取血后打开胸腔，生理盐水冲洗肺循环，取右上肺叶，中性甲醛保存，备病理切片HE及免疫组化染色；其余肺叶放入冻存管，立即放入液氮罐冻存，待取材全部完成后移入-80 ℃冰箱保存备用。

三、检测指标

①采用双夹心抗体酶联吸附免疫法(ELISA)测定血清中IL-6、TNF-α浓度(检测方法按说明书操作)；②采用实时定量逆转录PCR(realtime PCR)检测肺组织中SP-A及SP-D mRNA表达量(检测方法按说明书操作)；③右上肺标本石蜡包埋切片。进行HE染色，进行病理组织学观察。包埋切片及染色等按常规操作完成。

四、统计学处理

结果

一、血清中IL-6，TNF-α浓度

血清中IL-6浓度：各时间组中，B组(保护组)较A组(感染组)小鼠血清中IL-6均有降低，但P值均大于0.05，见表1。

表1　小鼠血清中IL-6浓度(pg/ml)

注：a为t检验P值，b为秩和检验P值，-代表无数据

血清中TNF-α浓度各时间组中，治疗组较感染组小鼠血清中IL-6均有降低，但仅8 h时感染组(A组)与治疗组(B组)t检验P<0.05，见表2。

表2　小鼠血清中TNF-α浓度(pg/ml)

注：a为t检验P值，b为秩和检验P值，-代表无数据

二、肺组织中SP-A，SP-D mRNA表达量

在2 h及4 h时，肺组织中SP-A含量，B组较A组低；肺组织中SP-D mRNA含量，B组较A组高。在8 h时，肺组织中SP-A、SP-D mRNA含量，B组较A组低。见图1。但各组间t检验P>0.05，秩和检验2 h和4 h组，SP-D数据P<0.05。显示氨溴索可在短期内(2、4 h)促进SP-D的mRNA水平增高，见图2。

图1小鼠肺组织中SP-A，SP-D mRNA表达量(real time PCR)

图2肺组织HE染色病理切片；图为小鼠右上肺组织石蜡切片HE染色光镜下照片。A为对照组；B，C，D分别为2 h、4 h、8 h时A组和B组病理切片

三、小鼠肺组织石蜡切片HE染色病理观察

气道灌注铜绿假单胞菌后，2 h时肺组织病理变化以充血和水肿改变为主，肺泡结构破坏尚不明显；4 h时白细胞浸润较前增多，病灶肺泡壁结构部分破坏，肺泡腔及间质内可见出血，病灶外部位可见肺泡壁变薄且有断裂、肺泡腔增大，呈气肿表现；8 h时病灶部位肺组织破坏进一步加重，部分肺泡结构紊乱不清。

A组(感染组)与B组(保护组)相比较。2 h时肺组织充血水肿，B组较A组轻；4 h、8 h时的组织结构破坏，B组也较A组轻。

讨论

IL-6主要由固有免疫系统细胞(如巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞)分泌，也可由B淋巴细胞、内皮细胞、成纤维细胞分泌。主要功能为刺激T、B淋巴细胞分化生长，促进细胞毒性T淋巴细胞的功能，诱导急性期反应蛋白等。既往研究发现，血清IL-6水平在多种炎症反应和炎症相关性疾病中升高。TNF-α主要由巨噬细胞、T淋巴细胞、NK细胞分泌，主要功能是杀伤靶细胞和促进细胞凋亡，参与局部炎症和内皮细胞活化。IL-6，TNF-α和IL-1β长期以来被认为是炎症反应的一般标志物，其值与血清炎症反应强度呈正相关[9-10]。

本实验中，PA注入气管后各时间点(2、4、8 h)B组小鼠血清中IL-6浓度平均值均低于A组，且A组小鼠随时间进展，血清IL-6浓度均值有明显的上升趋势，在B组中则无该趋势。提示氨溴索预处理可能有助于减轻炎症反应程度。但各组数据标准差均较大，尤其A组标准差远大于B组数据，同时间点A、B两组间比较，P值均大于0.05，无统计学意义。考虑进一步实验需要加大样本量，以获得更可靠的数据。

PA注入气管后各时间点(2、4、8 h)感染组与保护组小鼠血清TNF-α的浓度具有一定差别，由于样本量偏小，标准差较大，故采用t检验对2 h, 4 h的数据进行分析，无明显统计学差异，进一步采用秩和检验也无明显差异；但8 h组保护组小鼠血清中TNF-α浓度为(22.13±1.50) pg/ml，而感染组小鼠的血清中TNF-α浓度为(24.71±0.87) pg/ml，P=0.0073，具有明显统计学差异。提示采用氨溴索预处理能明显降低感染PA小鼠的血清中TNF-α浓度。而采用秩和检验也提示具有统计学差异。

肺泡表面活性物质相关蛋白(surfactant associated protein, SP)主要由肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar epithelial type Ⅱ cell, AT2)合成分泌，是PS的重要组成部分，目前已发现SP-A, SP-B, SP-C, SP-D四种，其中SP-A是最早被发现且表达量最高的SP。SP具有调节肺泡表面张力、调节PS的合成分泌与再循环等多种生理作用，也是肺泡固有免疫的重要组成部分[11-12]。SP-A与SP-D是凝集素家族的亲水性大分子，体外研究表明SP-A、SP-D可增强肺泡巨噬细胞对PA的吞噬作用，SP-A还可增强中性粒细胞对PA的吞噬及杀伤作用[12-14]。通过对小鼠急性PA肺炎模型的研究显示，SP-A基因敲除小鼠对PA感染易感性增强[15]，SP-A、SP-D、SP-C基因敲除小鼠的肺泡巨噬细胞对PA吞噬能力减弱，肺内PA负荷增高(且在SP-A敲除小鼠中更显著)[16-17]；SP-A、SP-D基因敲除小鼠肺泡灌洗液中IL-6和TNF-ɑ含量增高(IL-6在SP-D基因小鼠中更高)[15-16]；SP-C基因敲除小鼠肺内则较对照组更早出现中性粒细胞浸润[17]；而SP-D基因敲除的小鼠，在内毒素血症中更易受肺损伤[18]。以上研究结果提示，SP在肺部PA急性感染的固有免疫中发挥重要作用。同时，有研究发现，PA可通过分泌酶类水解SP-A而逃避被吞噬[19]。

本实验中，肺组织中SP-A,SP-D mRNA表达的组间(感染组和保护组)比较出现不同结果：SP-A在2 h和8 h时感染组中表达水平均高于保护组，4 h时保护组表达水平高于感染组，但只有在8 h时感染组SP-A的水平明显高于保护组；而SP-D mRNA表达水平在2、4 h时感染组均明显低于保护组，在8h时保护组水平低于感染组。SP-D的表达峰值在感染后2 h，此后渐下降。

感染组则在8 h时SP-A达到最高表达水平后出现下降。出现这种现象，一种可能的解释是，氨溴索可能不是简单促进SP-A和SP-D的合成，而是减少其分解或促进其再摄取，从而减少SP-A和SP-D的消耗。另外，可能SP-A、SP-D分泌的途径和方式不同，在小鼠体内产生的作用也不同。进一步可考虑同步检测肺组织中SP-A,SP-D的蛋白含量以明确其分泌时空改变。

小鼠肺组织HE染色切片光镜下观察，各时间点均显示保护组病变较感染组病变均较轻，主要表现为水肿程度较轻，炎性细胞浸润较少和肺泡结构破坏较轻。但不同小鼠间病理表现差异较大，难以进行准确判断。

综上所述，氨溴索预处理对小鼠铜绿假单胞菌导致的急性肺部感染似有保护作用，表现为炎症反应的减轻，且该作用可能部分是通过调节SP功能而实现的。

参考文献

1Hirsch EB, Tam VH, Vincent H Tam. Impact of multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa infection on patient outcomes[J]. Expert Rev Pharmacoecon Outcomes Res, 2010, 10(4): 441-451.

2kerr KG, snelling AM. Pseudomonas aeruginosa: a formidable and ever-present adversary[J]. J Hosp Infect, 2009, 73(4): 338-344.

3梁笛, 王桂芳. 化痰药物氨溴索的非化痰作用研究进展[J]. 复旦学报(医学版), 2011, 38(6): 553-555.

4蔡洪流, 朱红, 李立斌, 等. 大剂量盐酸氨溴索对大鼠内毒素性肺损伤保护作用的实验研究[J]. 中国急救医学, 2006, 26(8)：605-607.

5李立斌, 蔡洪流, 方强, 等. 盐酸氨嗅索预先给药对内毒素诱导大鼠急性肺损伤的作用[J]. 中华麻醉学杂志, 2006, 26(7): 655-658.

6Gao x, Huang Y, Han Y, et al. The protective effects of Ambroxol in Pseudomonas aeruginosa-induced pneumonia in rats[J]. Arch Med Sci, 2011, 7(3): 405-413.

7马玉腾, 田英平, 苏建玲, 等. 氨嗅索对百草枯中毒大鼠肺组织损伤及肺表面活性蛋白-A的影响[J]. 中华劳动卫生职业病杂志, 2006, 24(6)：348-351.

8Seifart C, Clostermann U, Seifart U, et al. Cell-specific modulation of surfactant proteins by ambroxol treatment[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2005, 203(1): 27-35.

9Mercedes Rincon, Charles G. Irvin. Role of IL-6 in Asthma and Other Inflammatory Pulmonary Disease[J]. Int J Biol Sci, 2012, 8: 1281-1290.

10何维 主编. 医学免疫学[M]. 第2版, 北京: 人民卫生出版社，2010: 94-95, 414-415.

11Seifart C, Clostermann U, Seifart U, et al. Cell-specific modulation of surfactant proteins by ambroxol treatment[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2005, 203(1): 27-35.

12khubchandam KR, oberley RE, snyder JM, et al. Effects of Surfactant

Protein A and NaCl Concentration on the Uptake of Pseudomonas aeruginosa by THP-1 Cells[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2001, 25(6): 699-706.

13Mikerov AN, Wang G, Umstead TM, et al. Surfactant Protein A2 (SP-A2) variants expressed in CHO cells stimulate Phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa more than do SP-A1 variants[J]. Infect Immun, 2007, 75(3): 1403-1412.

14Restrepo CI, Dong Q, Savov J, et al. Surfactant Protein D Stimulates

Phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa by Alveolar Macrophages[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 1999, 21(5): 576-585.

15Levine AM, Kurak KE, Bruno MD, et al. Surfactant protein-A-deficient

mice are susceptible to Pseudomonas aeruginosa Infection[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 1998, 19(4): 700-708.

16Giannonie, Sawa T, Allen L, et al. Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2006, 34(6): 704-710.

17Glasser SW, Senft AP, Whitsett JA, et al. Macrophage Dysfunction and Susceptibility to Pulmonary Pseudomonas aeruginosa Infection in Surfactant Protein C-Deficient Mice[J]. J Immunol, 2008, 181(1): 621-628.

18King BA, Kingma PS. Surfactant protein D deficiency increases lung

injury during endotoxemia[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2011, 44(5): 709-715.

19kuang Z, Hao Y, Hwang S, et al. The Pseudomonas aeruginosa flagellum

confers resistance to pulmonary surfactant protein-A by impacting the production of exoproteases through quorum-sensing[J]. Molecular Microbiol, 2011, 79(5): 1220-1235.

(本文编辑：黄红稷)

杨青，王桂芳，赵虎. 氨溴索对小鼠铜绿假单胞菌肺部感染的作用以及对肺组织表达肺泡表面活性物质相关蛋白的影响[J/CD]. 中华肺部疾病杂志： 电子版， 2015， 8(6)： 715-719.

【摘要】目的探讨氨溴索预处理对铜绿假单胞菌急性肺部感染的作用及对调节肺泡表面活性物质-A(SP-A)和肺泡表面活性物质-D(SP-D)表达水平的影响。方法选择健康雄性小鼠42只随机分成3组，对照组6只，感染组18只，保护组18只，建立小鼠铜绿假单胞菌(PA)急性肺部感染模型，感染组与保护组分别直接给予PA或腹腔注射氨溴索后再给予PA，用酶联免疫吸附测定(ELISA)法分别检测2、4、8 h小鼠血清白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度以评估体内炎症反应程度，通过组织石蜡切片，HE染色观察小鼠肺组织病理改变情况，采用PCR法检测氨溴索预处理对小鼠肺组织SP-A和SP-D mRNA表达的影响。 结果感染组和保护组2、4、8 h小鼠血清中IL-6浓度分别为(58.25±27.56)vs.(49.30±7.44)pg/ml,(68.59±43.46)vs.( 46.68±8.45)pg/ml,(109.76±76.49)vs.(49.77±15.14)pg/ml；感染组和保护组2、4、8 h小鼠血清中TNF-α浓度分别为(22.77±1.64)vs. (22.50±1.06) pg/ml、 (27.67±4.59)vs. (22.35±0.61) pg/ml 、(24.71±0.87)vs. (22.13±1.50)pg/ml。结论氨溴索预处理可以降低血清IL-6和TNF-α的水平，特别是明显降低处理8 h时小鼠血清中TNF-α水平(P=0.0073)，提高肺组织SP-A、SP-D mRNA的表达，改善肺组织的炎症反应；表明氨溴索对小鼠PA急性肺损伤具有一定的保护作用，且该作用可能是部分通过调节SP的功能而实现的。

【关键词】铜绿假单胞菌；氨溴索；肺部感染；相关蛋白，肺泡表面活性物质

Effects of ambroxol on the lung infection induced by Pseudomonas aeruginosa and the pulmonary surfactant associated protein in the lungYangQin1,WangGuifang2,ZhaoHu2.1CenterforClinicalMedicine(Eight-YearMajor),ShanghaiMedicalSchool,FudanUniversity,Shanghai200032,China；2LaboratoryMedicine,EastChinahospitalaffiliatedtofudanuniversity,Shanghai200032,China

Correspondingauthor：ZhaoHu,Email:hubertzhao@163.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of t pretreatment of ambroxol to the injured lung tissue after Pseudomonas aeruginosa (PA) infection and the regulation of expression of surfactant protein A (SP-A) and surfactant protein D(SP-D). MethodsIn this study, 42 mice were divided randomly into 3 groups (normal control 6 mice, PA infection 18 mice and PA infection after ambroxol pretreatment 18 mice). At 2 h, 4 h and 8 h, the concentration of interleukin-6 (IL-6) and tumour necrosis factor-α(TNF-α) in the serum were detected by enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA), pathological changes in injured lung tissues were observed by HE-staining, and the expression of SP-A, SP-D mRNA were detected by PCR. All these detections reflected the severity of the pulmonary inflammation in mice. ResultsAt 2 h, 4 h and 8 h, the concentration of IL-6 in infection group and protection group were(58.25±27.56)vs.(49.30±7.44)pg/ml,(68.59±43.46)vs.( 46.68±8.45)pg/ml,(109.76±76.49)vs.( 49.77±15.14)pg/ml . At 2 h, 4 h and 8 h, the concentration of TNF-α in infection group and protection group were (22.77±1.64)vs. (22.50±1.06) pg/ml, (27.67±4.59)vs. (22.35±0.61) pg/ml, (24.71±0.87)vs. (22.13±1.50)pg/ml. The results showed that ambroxol pretreatment decreased the level of IL-6 and TNF-α, the level of TNF-α at 8 h was decreased (P=0.0073.) increased the expression of SP-A、SP-D mRNA and improved the pathological changes of lung tissues. ConclusionThe present study concluded that ambroxol could provide protection for PA induced pulmonary infection, and this function might partially be realized through its regulation on the expression of SP.

【Key words】Pseudomonas aeruginosa;Ambroxol;Acute lung infection;Surfactant associated protein

(收稿日期：2015-05-23)

中图法分类号：R563

文献标识码：A

通讯作者：赵虎，Email: hubertzhao@163.com

基金项目：复旦大学学生学术科技创新基金“正谊学者”资助项目
作者单位： 200032 上海，复旦大学上海医学院临床医学专业(八年制)08级`1
200032 上海，复旦大学附属华东医院检验科`2

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.06.009