甲氨蝶呤、环磷酰胺对胶原诱导性关节炎大鼠血清TNF-α、IL-1的影响

梁美娥，李小峰，张莉芸，许 珂，王彩虹，曲世晶

甲氨蝶呤、环磷酰胺对胶原诱导性关节炎大鼠血清TNF-α、IL-1的影响

梁美娥1，李小峰2*，张莉芸1，许 珂1，王彩虹2，曲世晶3

目的 研究甲氨蝶呤(MTX)联合环磷酰胺(CTX)治疗对胶原诱导性关节炎(Collagen-induced arthritis，CIA)大鼠血清TNF-α、IL-1水平的影响，探讨甲氨蝶呤(MTX)联合环磷酰胺(CTX)治疗类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)的机制。方法 建立Ⅱ型胶原诱导的雌性Wistar大鼠CIA模型。取15只未造模的健康大鼠作为健康对照组(A组)。将造模成功的75只大鼠随机分成5组(每组15只)，B组：造模对照组；C组：小剂量MTX组(每周0.9 mg/kg)；D组：大剂量MTX组(每周2.7 mg/kg)；E组：小剂量CTX组(每3周24 mg/kg)；F组：小剂量MTX联合小剂量CTX组(MTX每周0.9 mg/kg，CTX每3周24 mg/kg)。分别在6周、24周检测各组大鼠血清中TNF-α、IL-1的水平。结果 联合应用MTX和CTX优于小剂量MTX、小剂量CTX单药治疗组。结论 MTX和CTX联合应用在RA的治疗中具有协同效应。

胶原诱导性关节炎；甲氨蝶呤；环磷酰胺；协同效应

0 引言

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种高度致残的自身免疫性疾病，炎性细胞因子在放大全身免疫紊乱和关节局部破坏中发挥了重要作用，以IL-1、TNF-α作用最为显著，最终导致周围关节的慢性、对称性、侵蚀性关节炎以及关节外血管炎。可以改善RA病情的抗风湿药物有甲氨蝶呤(MTX)、环磷酰胺(CTX)等。以往研究已证实，抗风湿药物的联合应用优于单药治疗[1-2]。本研究采用胶原诱导性关节炎(Collagen induced arthritis，CIA)大鼠模型[3]检测MTX、CTX单药及联合用药后CIA大鼠血清中细胞因子IL-1、TNF-α水平的变化，旨在探讨两者联合应用在治疗RA时是否有协同效应。

1 资料与方法

1.1 实验动物 雌性Wistar大鼠，购于山西医科大学实验动物中心，体重160～180 g，正常饲养。

1.2 实验试剂 MTX(上海信谊制药厂)，CTX(山西大同制药厂)，天然牛Ⅱ型胶原，完全弗氏佐剂(美国Sigma公司)，大鼠血清TNF-α检测试剂盒(晶美生物工程有限公司)，大鼠血清IL-1检测试剂盒(美国Biosource公司)。

1.3 造模和动物分组 根据文献[4]的方法加以改进。配制Ⅱ型胶原乳剂，初次免疫采用尾根部、背部、任一后足跖部多点皮内注射法，每只动物注射免疫复合物0.5 mL；2周后加强免疫，腹腔注射免疫复合物0.2 mL(含Ⅱ型胶原0.2 mg)[5]。根据关节炎指数(Arthritis index，AI)评分标准评估造模是否成功。取15只未造模的健康大鼠作为健康对照组(A组)。将75只造模成功的CIA大鼠，于造模第21天随机分成5组，每组15只，B组：造模对照组；C组：小剂量MTX组(每周0.9 mg/kg)；D组：大剂量MTX组(每周2.7 mg/kg)；E组：小剂量CTX组(每3周24 mg/kg)；F组：小剂量MTX联合小剂量CTX组(MTX每周0.9 mg/kg，CTX每3周24 mg/kg)。

1.4 给药方法 初次免疫设为第1天，至动物全部处死，历时24周。初次免疫后3周，C、D、E、F组开始给药，治疗21周，每3周为1个周期。①MTX：制成MTX混悬液，采用灌胃给药法，C组0.9 mg/kg，每周1次；D组2.7 mg/kg，每周1次；首次给药为初次免疫后3周，共给药21次。②CTX：于给药当天制成CTX混悬液，采用腹腔注射给药法；给药剂量为24 mg/kg，每3周1次；CTX给药应晚于MTX 1 d，即首次给药为初次免疫后22 d，共给药8次。③正常组和造模对照组分别给予等量蒸馏水灌胃及等量0.9%氯化钠液注射。

1.5 采血及细胞因子的检测 每只大鼠予5%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉，待大鼠肌张力和结膜反射消失后，将其以俯卧位固定于解剖板，用1 cm左右的毛细管于眼眶下采血，留取2 mL全血，室温静置1 h后，3 000 r/min离心5 min，取上层血清约1 mL，分装于离心管，置于-70 ℃保存。于初次免疫前及初次免疫后每3周留取血清，直至24周。采用ELISA法检测血清中两种细胞因子的水平。

2 结果

本研究从初次免疫开始历时24周，A～E组分别存活8、10、9、8、9、9只。

6周与24周时B组大鼠血清中TNF-α、IL-1水平的比较见表1，24周时B组大鼠血清中TNF-α和IL-1水平均明显高于6周时(P<0.01)，表明在关节炎发生过程中TNF-α、IL-1水平呈现升高趋势。对24周时各组TNF-α、IL-1水平(见表2)进行单因素方差分析，结果显示，单独应用甲氨蝶呤或环磷酰胺对关节炎大鼠TNF-α、IL-1均有抑制作用，两药联合应用时对TNF-α、IL-1的抑制作用更强，两药具有协同作用，见表3、表4。

表1 未用药组细胞因子水平比较(U/L)

表2 24周细胞因子水平比较(U/L)

注：与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05；与C组比较，▽P<0.05；与D组比较，△P<0.05；与E组比较，※P<0.05

表3 完全随机分组两因素析因设计24周TNF-α水平的方差分析表

表4 完全随机分组两因素析因设计24周IL-1水平的方差分析表

3 讨论

关于RA的发病机制，一种学说认为，RA是抗原驱动，T细胞依赖的细胞因子、黏附分子和降解酶参与的炎症反应[6]。环境抗原进入机体后经过抗原提呈细胞处理，刺激T细胞、滑膜发生细胞免疫反应，释放多种细胞因子，从而导致关节损伤；细胞因子是RA炎症和关节损伤的重要介质，其中以“姐妹细胞因子TNF-а、IL-1”[7]最为重要，它们分别与相应受体TNF-a、IL-1结合后，导致IκB-B发生磷酸化并降解，导致活化NF-κB蛋白的释放和核转录，进一步调节TNF、IL-2、IL-6、IL-12、M-CSF、GM-CSF、G-CSF等细胞因子的表达，这些细胞因子通过调节IL-8、MCP-1、MCP-2等趋化因子而刺激E-cadherin、ICAM-1、VCAM-1等黏附分子的表达[8]，进一步活化细胞、体液免疫，从而产生如下效应而导致关节炎的发生。①激活并增强血管内皮细胞对黏附分子的表达，使血液中的白细胞通过与黏附分子相互作用而集中在关节腔，刺激结缔组织细胞和多形核细胞产生前列腺素等小分子炎症介质，使得在RA发病早期滑膜增生并渗出大量液体，同时导致关节囊、肌腱和腱鞘发生炎性改变，出现关节明显肿胀；②衬里层滑膜成纤维细胞大量增生，富含有血管的肉芽组织从关节软骨边缘的滑膜向软骨面伸展，最后将软骨完全覆盖，阻断软骨从滑液中摄取营养，软骨发生溃疡，表面的肉芽组织纤维化，使上下关节面相互融合，形成纤维性强直；③刺激滑膜细胞和软骨细胞，使破骨细胞减少糖蛋白合成，增加糖蛋白降解，并产生过量的胶原酶、中性蛋白酶、金属蛋白酶、纤维蛋白溶酶激活剂、一氧化氮、基质溶素、蛋白聚糖、变性蛋白酶，使得软骨基质崩解，骨质疏松，肌肉和皮肤萎缩，关节本身畸形或脱位；④有活性的NF-κB在细胞核内通过抑制胱天蛋白酶-8、10途径发挥抗凋亡作用，从而阻断淋巴细胞、树突细胞、巨噬细胞、滑膜细胞的凋亡，并使免疫细胞发挥正常功能，从而导致免疫系统的紊乱和局部炎症反应的持续[9]。故TNF-α、IL-1是RA炎症形成、血管翳进一步增生、软骨和骨破坏的“罪魁祸首”[10-12]。

目前，MTX是治疗RA的首选药物。它是二氢叶酸还原酶抑制剂，通过使胸腺嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸的合成原料耗竭而抑制DNA和RNA的合成，从而发挥细胞毒作用[13-17]。MTX主要作用于S期，对G0/G1到S期转换有延缓作用。MTX的常用剂量为7.5～25 mg/周，其疗效容易达到平台即类似耐药现象，而增加剂量可引起较多不良反应；故在RA的治疗中常采取MTX联合其他药物的治疗方案。CTX是烷化剂，主要抑制DNA合成，同时对RNA和蛋白质合成也有抑制作用；其对各期细胞均有杀伤作用，尤其对G0/G1期和G2/M期细胞杀伤作用最强，属细胞周期非特异性药物。在治疗RA时，MTX、CTX联合应用可增强细胞毒作用[2]；同时，应根据细胞周期，小剂量间歇性点式给药。有体外实验证实：联合组较单药组对RA患者外周血淋巴细胞(PBL)抑制率明显增加；细胞周期检测，联合组PBL的G0/G1期比例明显增多，细胞增殖指数降低，表明MTX、CTX联合用药在抑制RA患者的PBL增殖方面可能有协同作用[18]。

本研究显示，未用药组CIA大鼠24周时血清中TNF-α、IL-1水平高于6周时，表明在关节炎发生过程中TNF-α、IL-1水平呈现升高趋势；24周时小剂量联合治疗组与高剂量MTX组对TNF-α、IL-1水平的影响程度相当，明显优于小剂量单用药组；进一步对24周时各药对TNF-α、IL-1影响的析因设计的方差分析结果显示，MTX与CTX联合应用时具有协同作用。

综上所述，MTX与CTX具有协同作用，故二者联合应用于RA的治疗，可能效果更好。

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Effect of methotrexate and cyclophosphamide intermittent combination therapy on serum levels of IL-1,TNF-α in collagen-induced arthritis rats

LIANG Mei-e1,LI Xiao-feng2*,ZHANG Li-yun1,XU Ke1,WANG Cai-hong2,QU Shi-jing3

(1.Department of Rheumatology and Immunology,Shanxi Dayi Hospital,Taiyuan 030032,China; 2.Department of Rheumatology and Immunology,The Second Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China; 3.Department of Internal Medicline,The Third Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China)

Objective To study the effect of methotrexate (MTX) and cyclophosphamide (CTX) intermittent combination therapy on serum TNF-α and IL-1 levels in collagen-induced arthritis (CIA) rats,in order to investigate the possible synergistic effect of the two drugs in the treatment of rheumatoid arthritis (RA).Methods A total of 90 Wistar rats were involved.Among them,75 received two times mixed liquor of cattle Ⅱ collagen and Freund′s complete adjuvant (CFA) by endermic injection to construct CIA rat model,and then divided into 5 groups randomly (15 rats in each group) and received MTX and CTX intermittent combination therapy or control drugs,respectively for 24 weeks.Another 15 non-CIA model rats were included as control group.The changes of arthritis index,arthritis swelling degree,and appearance of imageology and pathology were observed; the serum levels of IL-1 and TNF-α were detected by enzyme-linked immunosorbent assay.Results MTX in the doses of 0.9 mg/kg and 2.7 mg/kg a week could inhibit the appearance of arthritis and serum levels of IL-1 and TNF-α in CIA rats.CTX in a dose of 24 mg/kg every 3 weeks had the same effects.Combination of MTX 0.9 mg/kg a week and CTX 24 mg/kg every 3 weeks could inhibit arthritis index,arthritis swelling degree,and serum levels of IL-1 and TNF-α in CIA rats obviously,and the effect was better than single use of MTX or CTX.Conclusion MTX and CTX have synergistic effects at low dosage in the treatment of CIA.

Collagen-induced arthritis；Methotrexate；Cyclophosphamide；Synergistic effect

2015-01-13

1.山西大医院风湿免疫科，太原 030032；2.山西医科大学第二医院风湿免疫科，太原 030001；3.山西医科大学第三医院内科，太原 030001

山西省自然科学基金(200711116)

10.14053/j.cnki.ppcr.201507007

*通信作者