冬凌草甲素对胰腺癌SW1990细胞的抑制作用及机制

王文兰，付彩文，付文浩，柳树芳，王姝莲，程三芳

冬凌草甲素对胰腺癌SW1990细胞的抑制作用及机制

王文兰1a，付彩文2，付文浩1a，柳树芳1a，王姝莲1a，程三芳1b

目的 探讨冬凌草甲素对人胰腺癌SW1990细胞增殖的抑制作用及其作用机制。方法 以10、20、40 μmol/L不同浓度冬凌草甲素(Ori)作用于胰腺癌SW1990细胞，采用CCK-8检测胰腺癌SW1990细胞增殖情况；流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况；RT-PCR法检测Survivin、p21基因mRNA表达水平。结果 不同浓度的Ori作用于胰腺癌SW1990细胞1、2、3 d后，胰腺癌SW1990细胞增殖抑制程度不等，药物浓度越高，抑制程度越高，两者间具有明显剂量与时间依赖性。0、10、20、40 μmol/L的冬凌草甲素作用于胰腺癌SW1990细胞24 h后，凋亡率分别为0.87%±0.65%、1.85%±1.02%、5.38%±0.15%和16.60%±0.50%，出现明显的G2/M期周期阻滞。与对照组相比，10、20、40 μmol/L的Ori作用于SW1990细胞24 h后，p21 mRNA表达增加，而Survivin mRNA表达下降。结论 冬凌草甲素通过诱导凋亡和G2/M期周期阻滞来实现对胰腺癌SW1990细胞增殖的抑制作用，其机制可能与Survivin和p21调节信号有关。

冬凌草甲素；胰腺癌；SW1990细胞；增殖抑制

0 引言

胰腺癌作为一种预后较差的恶性肿瘤，近年来的发病率呈逐年上升趋势，具有极低的5年生存率和治愈率[1]。细胞凋亡的急剧减少在胰腺癌发生、发展以及对放化疗的耐受情况起重要作用。冬凌草甲素(Oridoni，Ori)作为一种从唇形科植物香菜属植物提取的重要活性二萜成分，具有抗炎、抑菌以及抗肿瘤等的药理作用，可以诱导肿瘤细胞凋亡并抑制肿瘤细胞的增殖[2]。人胰腺癌SW1990细胞是分子生物学意义上的胰腺癌标志性细胞，在胰腺癌临床诊断中具有重要意义[3]。本研究针对Ori对人胰腺癌SW1990细胞增殖的抑制作用及其作用机制进行探讨，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 药物和细胞株 Ori购自湖北巨胜科技有限公司(纯度在98%以上)；胰腺癌SW1990细胞株来源于中国科学院上海细胞库。根据Ori的浓度不同分为0(对照组)、10、20、40 μmol/L浓度组。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8检测胰腺癌SW1990细胞增殖情况 将处于对数生长期的人胰腺癌SW1990细胞种植到96孔板中，每孔细胞数量为5×103，细胞贴壁后将不同浓度的Ori(0、10、20、40 μmol/L)分别加入到孔板中，每个浓度设置6个复孔，并将加入0.1%的DMEM培养基液的细胞作为对照组，分别培养1、2、3 d。在药物作用结束前1 h，在每个孔中加入0.01 mL的CCK-8后继续培养1 h，使用酶标仪进行检测。细胞抑制率=(1-实验组/对照组)×100%。

1.2.2 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况 采用Annexin Ⅴ-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况。将处于对数生长期的人胰腺癌SW1990细胞种植到6孔板中，每孔的细胞数量为4×105，细胞生长至90%融合时，每孔中加入40 μmol/L的Ori，1 d后收集细胞，使用胰蛋白酶进行消化后，以1 000 r/min的速度离心5 min。冷PBS洗2次，并用0.5 mL的PBS重悬细胞加入到RNA酶中，使浓度变为100 μg/L，置37 ℃水浴中0.5 h，加入5 μL PI进行混匀后15 min上机检测，激发波长488 nm，发射波长530 nm，结果采用Cellquest软件进行分析。

1.2.3 RT-PCR法检测Survivin、p21基因mRNA表达水平 将处于对数生长期的人胰腺癌SW1990细胞采用不同浓度的Ori(0、10、20、40 μmol/L)进行处理后加入TRIzol 1 mL抽提细胞RNA，并按照逆转录试剂盒上的操作说明合成cDNA，采用GeneAmp9600型PCR扩增仪进行扩增。Survivin以及p21基因mRNA的反应条件：预变性94 ℃ 4 min，变性94 ℃ 30 s，退火54 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，最后延伸10 min，一共进行30个循环。将PCR产物置于1.5%的琼脂凝胶电泳中进行检测。

1.3 评价指标 CCK-8检测胰腺癌SW1990细胞增殖情况；流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况；RT-PCR法检测Survivin、p21基因mRNA表达水平。

2 结果

2.1 CCK-8检测Ori对胰腺癌SW1990细胞增殖抑制作用 不同浓度的Ori作用于胰腺癌SW1990细胞1、2、3 d后，胰腺癌SW1990细胞增殖抑制程度不等，药物浓度越高，抑制程度越高，两者间具有明显剂量与时间依赖性。见图1。

图1 不同浓度的Ori对胰腺癌SW1990增殖的抑制作用

2.2 流式细胞仪检测胰腺癌SW1990细胞凋亡情况 0、10、20、40 μmol/L的Ori作用于胰腺癌SW1990细胞24 h后，凋亡率分别为0.87±0.65、1.85±1.02、5.38±0.15和16.60±0.50，出现明显的G2/M期周期阻滞。见表1。

表1 不同浓度Ori作用于SW1990细胞24 h后细胞凋亡情况

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.3 不同浓度Ori作用于SW1990细胞24 h后，RT-PCR检测结果 与对照组相比，10、20、40 μmol/L的Ori作用于SW1990细胞24 h后，p21 mRNA表达增加，而Survivin mRNA表达下降，具体见图2、图3。

3 讨论

胰腺癌作为临床恶性程度较高的肿瘤类型之一，其肿瘤在生长过程中无特异性表现，具有早期临床症状隐匿的特点，极易出现转移，大多数胰腺癌在确诊时已属晚期[4]。传统的放射和手术治疗对这种侵袭性的肿瘤进展疗效甚微，只有对胰腺癌的分子生物学机制进行深入的研究才能寻找出一种有效的靶点进行早期诊断和治疗。Survivin基因是目前为止抗凋亡活性最强的抗凋亡基因，几乎在所有恶性肿瘤中都具有较高的表达水平，但在正常组织中则检测不到[5]。

图2 流式细胞仪分析的Ori处理24 h SW1990细胞的DNA直方图

图3 RT-PCR检测在SW1990细胞中p21 mRNA、Survivin mRNA的表达情况

Ori作为一种从唇形科植物香菜属植物提取的重要活性二萜成分，其主要的植物来源为香茶菜、毛叶香茶菜以及冬凌草等植物[6]。Ding等[7]研究显示，Ori对多种肿瘤细胞均有明显的抑制作用，通过诱导细胞进行程序性死亡以达到调节生物体细胞群数目相对稳定的目的，而几乎所有的抗肿瘤药物都是通过诱导细胞凋亡来达到其抗肿瘤目的。本研究结果显示，不同浓度的Ori作用于胰腺癌SW1990细胞1、2、3 d后，胰腺癌SW1990细胞增殖抑制程度不等，药物浓度越高，抑制程度越高，两者间具有明显剂量与时间依赖性。证实Ori可以诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖。刘军楼等[8]研究显示，Survivin基因具有调节细胞有丝分裂以及抑制细胞凋亡的双重功能，这是由于Survivin基因在G2/M时期呈特异性表达，是G2/M的调节因子，此时Survivin与纺锤体的微管进行特异性结合，从而维持细胞有丝分裂的正常进行。Bu等[9]研究显示，G2/M期调控点是细胞内外信号进行传递、整合与收集的重要调控点，通过将这些信号收集到细胞核从而对细胞的增殖进行调控。细胞增殖的G2/M期是RNA合成染色质螺旋化的时期，此时细胞对外界环境的影响较为敏感，也是进行肿瘤放化疗最敏感的时期[10]。另外，Ori通过抑制胰腺癌SW1990细胞的生长从而发生细胞凋亡，还可以提升三氧化二砷及伊马替尼等化疗药物的促凋亡作用。本研究中，通过将10、20、40 μmol/L的Ori作用于胰腺癌SW1990细胞，出现明显的G2/M期周期阻滞。证实细胞周期阻滞是Ori抑制胰腺癌细胞的主要机制，且Ori可以降低人胰腺癌SW1990细胞中Survivin mRNA的表达，从而解除对Caspase-3的抑制作用，以促进肿瘤细胞的凋亡[11]。p21作为一种广谱的周期依赖性蛋白激酶，可以与细胞周期蛋白竞争性地与周期素依赖的蛋白结合，从而抑制该酶活性，降低对靶蛋白发挥磷酸化作用的能力。本研究结果显示，与对照组相比，10、20、40 μmol/L的Ori作用于SW1990细胞24 h后，p21 mRNA表达增加，而Survivin mRNA表达下降。从而证实Ori通过使Survivin mRNA表达下降以及p21 mRNA表达增加等方式来诱导细胞发生凋亡以及周期阻滞，从而抑制人胰腺癌SW1990细胞的增殖，且呈时间剂量依赖。

综上所述，Ori可以明显抑制人胰腺癌SW1990细胞的增殖，并诱导凋亡和G2/M期周期阻滞来实现对胰腺癌SW1990细胞增殖的抑制作用，其机制与Survivin和p21调节信号有关。

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Inhibiting effect of oridonin on human pancreatic cancer cell line SW1990 and its mechanism

WANG Wen-lan1a，FU Cai-wen2，FU Wen-hao1a，LIU Shu-fang1a，WANG Shu-lian1a，CHENG San-fang1b

(1.a.The Second Department of Internal Medicine,b.Department of Pharmacy,Shexian County Hospital of Traditional Chinese Medicine,Handan 056400,China; 2.Department of Radiology,Shexian County Hospital,Handan 056400,China)

Objective To investigate the inhibit effect of oridonin on human pancreatic cancer cell line SW1990 and its mechanism.Methods SW1990 cells were induced with different concentrations (10,20,40 μmol/L) of oridonin,the proliferation of SW1990 cells were detected by CCK-8; cell cycle and apoptosis were measured by flow cytometry; RT-PCR assay was used to detect the expression level of survivin and p21 gene mRNA.Results Different concentrations of oridonin inhibited SW1990 cells proliferation in a time-and dose-dependent manner after 1d,2 d,3 d.Oridonin at 0,10,20,40 μmol/L caused obvious cell cycle arrest in G2/M phase,and 24 h apoptosis rate were 0.87%±0.65%、1.85%±1.02%,5.38%±0.15% and 16.60%±0.50%.Compared with control group,p21 mRNA expression increased,while Survivin mRNA expression decreased.Conclusion Oridonin inhibits SW1990 cells proliferation by inducing apoptosis and arresting G2/M phase cycle,which may be related to Survivin and p21 regulatory signals.

Oridonin; Pancreatic cancer; SW1990 cells; Inhibition of proliferation

2014-10-29

1.涉县中医院a.内二科，b.药剂科，河北 邯郸 056400；2.涉县医院放射科，河北 邯郸 056400

河北省中医药管理局科学技术研究计划(2008056)

10.14053/j.cnki.ppcr.201507003