葫芦素B抑制神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖机制的初步研究

郑 倩，宋冠华，张 斌

·论著·

葫芦素B抑制神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖机制的初步研究

郑 倩*，宋冠华，张 斌

目的 研究葫芦素B对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖的影响及其作用的分子机制。方法 通过MTT法检测葫芦素B对SH-SY5Y细胞增殖的影响，流式细胞仪检测葫芦素B对SH-SY5Y细胞凋亡和生理水平上活性氧含量、线粒体膜电位的影响。Hoechst 33258染色检测药物处理前后细胞形态的变化。Westernblot检测葫芦素B处理SH-SY5Y细胞24 h前后Bcl-2、Bax、p21、p53等蛋白合成的变化。结果 实验浓度范围内，葫芦素B可时间与浓度依赖性地抑制SH-SY5Y细胞增殖；浓度依赖性地诱导SH-SY5Y细胞凋亡、活性氧水平升高和线粒体膜去极化；在蛋白水平上，葫芦素B能诱导凋亡抑制蛋白Bcl-2下调，促凋亡蛋白Bax、p21、p53上调。结论 葫芦素B在体外能显著抑制SH-SY5Y细胞增殖，这一影响可能通过诱导细胞凋亡、ROS积累、线粒体膜去极化及其相关蛋白表达变化来实现。

葫芦素B；SH-SY5Y细胞；细胞凋亡；活性氧

0 引言

葫芦素是从葫芦科植物中提取的一种四环三萜化合物，具有多种生物活性，如免疫、抗炎、抗菌作用，同时还具有抗肿瘤的效果。在化学结构上，不同葫芦素之间有很大的差别。根据具有氧化功能的四环烷基骨架所在的位置不同，将葫芦素分为12类，如B、D、E、K、I、L、Q等，葫芦素B是含量最为丰富的一类，目前对其研究也有很多(主要为抗肿瘤方面的研究[1])。葫芦素B具有很多生物活性，主要用于慢性肝炎的治疗[2]。近年研究报道显示，低浓度的葫芦素B可对多种肿瘤细胞起到抑制作用，如白血病、黑色素瘤和喉癌等，而且葫芦素B在不同肿瘤细胞中的作用机制并不完全相同[3-5]。目前，国内外对于葫芦素在神经母细胞瘤细胞中的毒性及其内在机制的研究还未见报道。本试验通过检测葫芦素B对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖、凋亡、活性氧含量、线粒体膜电位及其相关蛋白表达的影响，从生理与分子细胞水平上研究葫芦素B对神经母细胞瘤细胞的影响及其内在机制，为神经母细胞瘤的治疗提供新的思路。

1 材料

1.1 试剂 葫芦素B(CucurbitacinB，CuB，98%)购自成都曼斯特生物技术公司，胰酶消化液、BCA蛋白浓度测定试剂盒以及活性氧、线粒体膜电位检测试剂盒均购自碧云天生物技术研究所，DMEM高糖液体培养基和无支原体胎牛血清购自HyClone公司，MTT和DMSO购于美国Sigma公司。Annexin-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司，β-actin、Bcl-2、Bax、p53和p21等多克隆抗体购于Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔和羊抗鼠二抗购于武汉博士德生物工程公司。

1.2 细胞培养 人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系分别购自中国典型培养物保藏中心。用含10%无支原体胎牛血清和DMEM高糖培养基，37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

2 方法

2.1 细胞增殖测定 向96孔板中接种2×104个/孔的对数生长期SH-SY5Y细胞，待细胞贴壁后，去除旧培养基，加入含有不同浓度葫芦素B的新鲜培养基，继续培养24 h或48 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，孵育4 h，弃上清，每孔加入100 μL DMSO，继续37 ℃暗培养15 min后，570 nm下测定每孔的OD值。每孔设4个复孔，并以完全培养基为空白对照。细胞增殖率=对照组吸光值/处理组吸光值×100%。

2.2 细胞凋亡检测 向6孔板中接种2×105个/孔的对数生长期SH-SY5Y细胞，葫芦素B处理24 h后，离心收集细胞，PBS洗涤2次，去上清，每个样品加入500 μL结合缓冲液重悬细胞，再加入5 μL AnnexinV-FITC和10 μL PI，混匀后室温下避光孵育15 min，尽快进行流式细胞仪检测。细胞凋亡率=凋亡细胞数目/总细胞数目×100%。

2.3 Hoechst 33258检测细胞形态变化 取6孔板中贴壁的SH-SY5Y细胞分别于含有DMSO和8 μM葫芦素B的培养基中培养24 h，然后用倒置光学显微镜观察处理前后细胞形态的变化。移除旧培养基，PBS洗细胞2次，然后加入Hoechst 33258染色液避光孵育3～5 min，最后吸出染色液，PBS洗2～3次，荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。

2.4 活性氧水平测定 葫芦素B处理24 h后的SH-SY5Y细胞收集于离心管中，PBS洗涤2次，去上清后加入100 μL DCFH-DA探针，37 ℃培养箱孵育20 min，每隔3 min颠倒混匀1次，PBS洗涤后，加入300 μL PBS重悬细胞，流式细胞仪检测。

2.5 线粒体膜电位水平检测 葫芦素B处理SH-SY5Y细胞24 h后，离心收集细胞，PBS洗细胞2次，加入500 μL JC-1染色工作液重悬，37 ℃孵育20 min。待孵育结束后用JC-1染色缓冲液洗细胞2次后，再用500 μL JC-1染色缓冲液重悬细胞，最后流式细胞仪检测荧光强度。

2.6 蛋白免疫印迹 葫芦素B处理SH-SY5Y细胞24 h后，离心收集并裂解细胞提取蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定后，根据标准曲线按每孔40 μg蛋白计算蛋白上样量。15%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳结束后湿法转膜，封闭液4 ℃封闭过夜，洗膜后分别以1∶200和1∶500比例加入特定抗体进行一抗和二抗室温孵育2 h，TBST洗膜后，化学发光成像系统检测蛋白表达情况。

2.7 统计学分析 计量资料比较采用t检验，所有数据均采用SPSS 10.0软件进行统计学分析。

3 结果

3.1 葫芦素B对SH-SY5Y细胞增殖的影响 MTT法检测不同浓度葫芦素B处理SH-SY5Y细胞24 h和48 h后细胞增殖的影响，见图1。结果显示，在实验浓度范围内，经过葫芦素B处理后，与对照组比较，SH-SY5Y细胞增殖率呈浓度、时间依赖性下降，且从8 μM浓度开始下降更显著。

图1 葫芦素B处理SH-SY5Y细胞后增殖率的变化

3.2 葫芦素B对SH-SY5Y细胞凋亡的影响 葫芦素B处理SH-SY5Y细胞24 h后，细胞凋亡率较对照组明显升高，且随着药物浓度的上升，细胞凋亡的比例上升。见图2。

3.3 葫芦素B对SH-SY5Y细胞形态的影响 经过葫芦素B处理后，细胞发生变圆、皱缩、体积变小等现象，经过Hoechst 33258染色后，在视野内可以观察到致密浓染的细胞，有较强的蓝色荧光，而正常细胞则呈现均匀的蓝色，且比葫芦素B处理过的细胞数目多。见图3。

3.4 葫芦素B对SH-SY5Y细胞活性氧水平的影响 见图4。由图4可见，葫芦素B处理SH-SY5Y细胞24 h后，与对照组比较，活性氧水平明显升高，且在药物浓度高于8 μM时，活性氧水平增加明显，且呈现剂量依赖性上升趋势。

图2 葫芦素B处理SH-SY5Y细胞24 h后细胞凋亡率的变化

图3 Hoechst 33258荧光染色结果

图4 葫芦素B处理SH-SY5Y细胞24 h后ROS水平的变化

3.5 葫芦素B对SH-SY5Y细胞线粒体膜电位的影响 葫芦素B处理SH-SY5Y细胞24 h后，细胞线粒体膜电位检测结果如图5所示，经过葫芦素B处理后，线粒体膜电位出现明显的去极化现象，且随着药物处理浓度的增加，细胞去极化的水平也在不断上升。

3.6 葫芦素B对与细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的影响 不同浓度葫芦素B处理SH-SY5Y细胞24 h后，Western blot检测细胞内Bcl-2、Bax、p53、p21蛋白表达结果见图6。结果显示，葫芦素B能够分别诱导抗凋亡的Bcl-2下调、促凋亡的Bax上调，另外，葫芦素B还能诱导与细胞增殖、凋亡相关的p53、p21上调。

图5 葫芦素B处理SH-SY5Y细胞24 h后线粒体膜电位的变化

图6 葫芦素B处理SH-SY5Y细胞24 h后蛋白表达的变化

4 讨论

人神经母细胞瘤(Neuroblastoma，NB)是儿童最常见的颅外恶性实体肿瘤，起源于神经外胚层细胞，发生于肾上腺髓质和交感神经系统，具有生物行为多样性的特点[6-7]。NB可自然消退，可转为良性，但大部分肿瘤快速发展而导致患儿死亡[8-9]。神经母细胞瘤的治疗主要包括手术、化疗、放疗和生物治疗，目前，化疗在NB的治疗中仍起重要作用，但由于化疗给患者带来痛苦和不良反应等，研究者一直在探索新的、有效的治疗方案。而中草药、植物药等天然产物中存在广泛的生物活性物质，从中草药、植物中筛选毒副作用小、作用独特的抗肿瘤药物成分，研究其抗癌机制，开发高效抗癌药物，具有重要意义。肿瘤发生的特点之一是细胞的恶性增殖，寻找能够抑制肿瘤细胞增殖和促进凋亡且对正常细胞毒副作用小的药物是促进研究开发抗癌药物的新途径。本试验中，葫芦素B作为从常见的葫芦科植物中提取的一种化学成分，能够表现出抑制神经肿瘤细胞增殖和促进凋亡的作用，为神经母细胞瘤的治疗和药物开发提供理论参考。

细胞凋亡的产生有多种途径，本实验通过MTT、流式细胞术、Western blot等方法从生理到分子水平检测了葫芦素B处理神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞后各方面的变化。结果显示，葫芦素B能够浓度依赖性地诱导SH-SY5Y细胞早期凋亡。细胞凋亡往往伴随着一系列形态上的改变，通过Hoechst 33258染色后细胞核呈现致密浓染，进一步证明了细胞在经过葫芦素B处理后出现了凋亡的形态学特征。ROS积累、线粒体膜电位下降都能促使细胞启动凋亡机制，而这两种生理变化之间又存在密切联系。近年研究表明，部分抗癌药物能够通过引起细胞内ROS水平升高来诱导细胞凋亡[10-11]。细胞内ROS主要来源于线粒体细胞器，产生于线粒体呼吸链[12]，在呼吸链的电子传递过程中，大约有2%～5%的离子发生逃逸释放出超氧离子，增加细胞的氧化损伤。ROS还能通过诱导DNA突变数目的增加、降低基因组稳定性、氧化膜质或直接激活与凋亡相关的基因或蛋白的表达等方式来促使细胞凋亡发生，且神经系统细胞对ROS水平变化更为敏感，从而更容易发生凋亡现象。本试验结果显示，葫芦素B能够引起SH-SY5Y细胞内ROS水平升高，进一步证明了葫芦素B具有诱导该细胞凋亡的作用。线粒体跨膜电位的形成依赖于线粒体呼吸链中产生的跨膜质子梯度。跨膜电位的维持与线粒体膜的完整性密不可分。在细胞凋亡过程中，线粒体膜通透性改变，一些离子的内流导致膜内外电位发生改变，从而造成线粒体膜电位下降，出现去极化现象。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族成员，分别具有抗凋亡和促凋亡的作用，二者在细胞凋亡途径中发挥重要作用。有报道，Bcl-2和Bax是线粒体凋亡途径中的关键蛋白，Bcl-2位于线粒体外膜，能够阻止细胞色素C的释放，而Bax最开始则处于无活性状态，只有当其进入线粒体之后才转化为激活的形式来促进细胞凋亡，抗凋亡的Bcl-2和促凋亡的Bax的蛋白量比对细胞的凋亡信号有一定的敏感性，Bcl-2/Bax比例下降可能是引起细胞凋亡的关键[13]。本试验中，葫芦素B处理之后能够使Bcl-2蛋白表达下调，Bax蛋白表达上调，从而导致Bcl-2/Bax比例下降。p53和p21能够抑制Bcl-2和CIAPs蛋白活性，激活促凋亡蛋白活性，促进细胞凋亡。

综上所述，本研究在细胞与分子水平上检测了葫芦素B对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的影响，表明葫芦素B能够剂量依赖性地抑制细胞增殖和诱导凋亡，说明葫芦素B具有一定的抗癌潜力和研发前景，对研究和治疗神经母细胞瘤具有重要的理论意义。

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Preliminary study on the inhibitory effect of cucurbitacin B on the proliferation of SH-SY5Y cells

ZHENG Qian*,SONG Guan-hua,ZHANG Bin

(Department of Life Science,Huizhou University,Huizhou 516007,China)

Objective To study the effect of cucurbitacin B on the proliferation of SH-SY5Y cells,and to clarify the molecular mechanism.Methods MTT assay was used to test the effect of cucurbitacin B on proliferation of SH-SY5Y cells. Apoptosis,ROS production and mitochondrial membrane potential of SH-SY5Y cells were detected by flow cytometry. Morphological changes of cells with or without drug treated were observed by Hoechst 33258 staining. The protein expression of Bcl-2,Bax,p21 and p53 was investigated by western blot. Results In the range of experimental dose,cucurbitacin B inhibited the proliferation of SH-SY5Y cells in dose-dependent and time-dependent manners,and also induced cell apoptosis,promoted ROS production,depolarized mitochondrial membrane potential in SH-SY5Y cells. In the protein level,the decreasing protein expression of Bcl-2,increasing protein expression of Bax,p21 and p53 were also observed in SH-SY5Y cells after cucurbitacin B treatment. Conclusion Cucurbitacin B inhibits the proliferation of SH-SY5Y cells significantly by inducing cell apoptosis,changing the physiological level and regulating the protein expressions of Bcl-2,Bax,p53 and p21.

Cucurbitacin B;SH-SY5Y cell;Cell apoptosis;ROS

2014-12-05

惠州学院生命科学系，广东 惠州516007

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201507001