诱导铁皮石斛生根发芽的二合一培养基

孙 庆 元，张 雪，朱 欢

（大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034）

0 引 言

铁皮石斛（Dendrobiumcandidum）是药用石斛中的珍品，其含有的多糖、生物碱、氨基酸等成分具有多种生物学功能［1－2］。由于人们对野生铁皮石斛的无节制采掘，使得野生铁皮石斛资源日渐枯竭，而铁皮石斛的种子极小，无胚乳，自然繁殖力极低，很难用实生苗进行人工栽培。常规繁殖分株、扦插等方式的繁殖率低，生长周期长，远不能满足生产上的需要［3］。因此，利用人工组培快速繁殖幼苗已成为种植种源的首要来源。

然而，目前组培方式诱导原球茎增殖、分化生芽、壮苗生根后完成组培苗的培养，这种方式原球茎分化生芽后需再转入生根培养基进行生根培养后才能完成组培苗的培养，两次移植培养增加了染菌概率和人工及培养基成本［4－5］。因此，本研究利用生根发芽二合一培养基，一次性移植铁皮石斛原球茎进行生芽生根，减少染菌概率和人工及培养基成本。

1 材料与方法

1.1 实验材料

取由铁皮石斛的嫩茎为外植体诱导60d后的圆球茎，实验材料取自大连工业大学生物工程学院组织培养实验室。

1.2 实验方法

选取相同条件下生长良好的铁皮石斛原球茎，在无菌条件下切成1cm 直径的小块，分别接在不同的培养基中，每瓶接入原球茎2g，每种培养基接种20 瓶，培养90d。采用统一的培养条件：室温保持25 ℃，相对湿度60%～80%，光照强度2 000lx，每天光照12h；每种培养基pH 为6.0，加入蔗糖20g／L，琼脂粉6g／L。

1.2.1 原球茎的生根生芽培养

铁皮石斛原球茎生根发芽以1／2MS 和N6为基本培养基，以ρ（KT）／ρ（NAA）、天然添加为研究因子，其中ρ（KT）／ρ（NAA）分别采用1.0／0.5、1.0／1.0、0.5／1.0三种处理方法。分别添加土豆汁或香蕉汁各100g／L，以1／2MS 和N6为基本培养基，不添加激素及天然添加物为对照组，培养90d，确定即最佳的培养基配方。

1.2.2 硝基氮氨基氮摩尔比对原球茎分化的影响

在不改变培养基中硝基氮和氨基氮总量基础上，按n（NO3）／n（NH4）＝3∶2、4∶3和1∶1三种处理方法，以1／2MS培养基为对照，分别培养90d，确定影响圆球茎分化的最适n（NO3）／n（NH4）。

1.2.3 氮含量对圆球茎分化的影响

增加氨基氮与硝基氮总量，分别增加5、10和15g／L，以“1.2.2”中确定的最佳培养基为对照，培养90d，确定影响圆球茎分化的最佳施用氮含量。

1.2.4 活性炭对圆球茎分化的影响

在“1.2.2”、“1.2.3”确定的最佳培养基中，分别添加30、60和90g／L活性炭，以不加入活性炭为对照，培养90d，确定影响圆球茎分化的最适活性炭施用量。

2 结果与分析

2.1 不同培养基配方及激素比对圆球茎根苗分化的影响

由表1可以看出，在1／2MS培养基和N6培养基加入土豆汁，对铁皮石斛原球茎的生芽和生根都未发现有促进作用，甚至加入不同质量浓度比的KT 和NAA 也未见明显的效果。但是土豆汁对铁皮石斛原球茎的增殖有明显的促进作用。

在两种培养基中加入的ρ（KT）／ρ（NAA）＝1.0／1.0时作用最明显，其中在1／2MS培养基中铁皮石斛原球茎增殖了6.3 倍；在N6 培养基中铁皮石斛原球茎增殖更多，是未添加的7.15倍。

香蕉泥对两种培养基中的铁皮石斛原球茎的生芽和生根都有促进作用，当ρ（KT）／ρ（NAA）＝1.0／1.0时作用更明显，且在1／2MS培养基中铁皮石斛原球茎生根和生芽效果最好。

综上所述，铁皮石斛原球茎生根及生芽最理想的基础培养基、天然添加物和激素组合为1／2MS培养基，香蕉泥100g／L，NAA 1.0mg／L，KT 1.0mg／L。

表1 不同添加物对培养基中圆球茎分化的影响Tab.1 The effect of different natural agents on the protocorm differentiation

2.2 硝基氮氨基氮摩尔比对圆球茎分化成苗的影响

由表2 可以看出，改变培养基中n（NO3）／n（NH4）对铁皮石斛生根和生芽均有促进作用，尤其对根分化影响更为突出。其中n（NO3）／n（NH4）＝4∶3效果最好，茎高增加51.7%、鲜重增加59%、根长增加3.86倍。

培养基中氨基氮硝基氮的比例对植物生长和分化影响不同［6］。同时使用氨基氮和硝基氮不仅可以保证营养元素平衡，也可避免在培养基中培养物对不同离子的吸收差异而产生培养基pH 的剧烈变化，影响培养物的生长与分化，如大多数植物培养过程中单独使用硝基氮时常会使pH 升高，单独使用氨基氮时则会使pH 降低。

表2 不同摩尔比的硝基氮与氨基氮培养基对圆球茎分化成苗的影响Tab.2 The effect of different n（NO3）／n（NH4）on the protocorm differentiation

2.3 氮含量的变化对圆球茎分化的影响

由表3可以看出，适当增加培养基中氮含量有益于铁皮石斛原球茎的生根和生芽。与对照组相比，加入10g／L时效果最佳，鲜重增加44.5%、茎高增加21.4%、根数增加1 倍、茎粗增加33.3%、根长增加10.4%、叶片颜色呈深绿色。

表3 氮含量对铁皮石斛圆球茎分化成苗的影响Tab.3 The effect of nitrogen content on the protocorm differentiation

2.4 活性炭对原球茎分化的影响

由表4可以看出，随着活性炭投加量的增加，铁皮石斛植株数减少，说明在培养基中加入活性炭对铁皮石斛圆球茎生芽有一定的抑制作用。加入30g／L 活性炭时鲜重增加78.9%、株数减少13.3%、茎高增加56.1%、根长增加45.5%、根数增加12.5%；加入60g／L 活性炭时鲜重增加34%、株数减少26.7%、茎高增加57.6%、根长增加84.8%、根数增加18.8%。活性炭质量浓度在30～60g／L对植株数影响不大，对植株的根数和根长有一定的促进作用。

活性炭可能促进了根系的呼吸作用，从而促进了根系的生长发育。发达的根系就会增强对营养的吸收，进而茎高和鲜重增加。虽然活性炭促进植株个体的生长，但是由于活性炭抑制了植株分化，植株数减少，从而影响了培养基中铁皮石斛总鲜重。

表4 活性炭对铁皮石斛圆球茎分化的影响Tab.4 The effect of active carbon on the protocorm differentiation

3 结 论

在N6和1／2MS培养基中分别加入土豆汁，对铁皮石斛原球茎的分化（生芽和生根）未发现有促进作用，但是对铁皮石斛原球茎的增殖有显著作用。1／2MS培养基中加入香蕉泥能促进铁皮石斛原球茎的分化，加入ρ（KT）／ρ（NAA）＝1.0／1.0对铁皮石斛原球茎的增殖和分化都是最适比例。1／2MS培养基中，n（NO3）／n（NH4）＝4∶3时，铁皮石斛原球茎分化效果最好；氮质量浓度为10g／L时，铁皮石斛原球茎分化效果达到最佳。活性炭质量浓度为30～60g／L时，铁皮石斛原球茎分化效果最好。铁皮石斛原球茎生根发芽二合一培养基的最适配方为1／2MS ＋香蕉汁10g／L＋KT 1.0mg／L＋NAA 1.0mg／L＋氮素10g／L＋活性炭30～60g／L。

［1］史宏志，韩锦锋，刘国顺，等.不同氮素营养的烟叶氨基酸含量与香吃味品质的关系［J］.河南农业大学学报，1997，31（4）：319－322.

［2］魏凤娟.铁皮石斛组织培养与栽培技术研究进展［J］.广东农业科学，2010（4）：81－85.

［3］陈兆贵，谭俊.不同激素配比对铁皮石斛组织培养的影响研究［J］.惠州学院学报，2006，26（3）：11－14.

［4］王培忠，赵欣，张宗申.东北矮紫杉细胞悬浮培养中褐化问题的研究［J］.安徽农业科学，2012，40（10）：5760－5762.

［5］温明霞，聂振朋，林媚，等.铁皮石斛组织培养与快速繁殖研究进展［J］.广西农业科学，2007，38（3）：227－229.

［6］谢从华，柳君.植物细胞工程［M］.北京：高等教育出版社，2005：75－87.