大鼠运动应激性胃溃疡模型的建立以及苦苣总黄酮的预防作用
李志坤1初海平1王福文1,2*
山东省医学科学院药物研究所济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院1(250062)
山东省罕少见病重点实验室2
背景:近年运动应激性胃溃疡受到广泛关注,有研究证实苦苣总黄酮有抗炎、抗氧化作用。目的:建立快速、稳定、可重复的大鼠运动应激性胃溃疡模型,并探讨苦苣总黄酮对运动应激性胃溃疡的干预作用。方法:100只Wistar大鼠随机分为安静对照组、1 h无负荷运动组、1 h负荷运动组、2 h无负荷运动组和2 h负荷运动组,每组20只,雌雄各半。采用游泳方式建立大鼠运动应激性胃溃疡模型,观察胃黏膜溃疡指数(UI)和病理学改变。40只雄性Wistar大鼠随机分空白对照组、1 h负荷运动模型组、大剂量苦苣总黄酮组(生药3.2 g/kg)和小剂量苦苣总黄酮组(生药1.6 g/kg),观察胃黏膜病理学改变,检测胃黏膜SOD以及胃黏膜和血清MDA含量。结果:与1 h负荷运动组相比,1 h无负荷运动组UI显著降低(P<0.01),2 h负荷运动组显著升高(P<0.01),2 h无负荷运动组无明显差异(P>0.05)。1 h、2 h无负荷运动组和1 h负荷运动组雄性大鼠UI明显高于雌性大鼠(P<0.05)。与空白对照组相比,1 h负荷运动后大鼠胃黏膜SOD含量明显降低(P<0.01),胃黏膜和血清中MDA含量明显上升(P<0.05),大剂量苦苣总黄酮可明显改善上述指标(P<0.05)。结论:1 h负荷游泳运动可有效快速地建立大鼠运动应激性胃溃疡模型。大剂量苦苣总黄酮对运动引起的大鼠应激性胃溃疡有明显预防作用。
关键词胃溃疡;游泳;苦苣总黄酮;氧化性应激
运动是一种特殊的生理病理过程,同时也是一种强烈的应激原[1]。临床资料表明,竞技运动员尤其是长跑或马拉松运动员,在运动期间常会发生出血、腹泻或胃肠综合征,从而影响正常训练和比赛。目前运动应激性胃溃疡的研究多以力竭性运动来诱发,存在实验条件不同、运动时间长短不一、力竭标准不统一等问题,影响了研究的进一步开展和评价。苦苣(Sonchus oleraceus L.)为菊科植物苦苣菜的全草,主要含黄酮类化合物,此外还含有香豆素类、木质素类、甘油酸酯苷类化合物[2]。该植物及其提取物具有保肝、抗肿瘤、利尿、降血糖、降胆固醇、抗炎、抗氧化、抗凝血、抗菌、解毒、改善脑缺血缺氧的作用[3]。目前尚未见苦苣提取物对运动应激性胃溃疡干预作用的研究报道。为此,在前期研究的基础上,本研究拟通过给予大鼠游泳运动,观察不同负荷、不同游泳时间对运动应激性胃溃疡形成的影响,以期逐渐摸索出一套操作简便、稳定、可重复和成功率高的动物模型,为运动应激性胃溃疡的临床康复和预防以及后期研究提供实验理论依据,同时探讨苦苣总黄酮对运动应激性胃溃疡的预防作用。
材料与方法
一、实验材料
1. 实验动物:健康Wistar大鼠140只,其中雌性50只,雄性90只,体质量220~250 g,由山东鲁抗医药股份有限公司实验动物中心提供,生产许可证号:SCXK(鲁)20130001。
2. 主要药物和试剂:SOD测定试剂盒,批号:20140103;MDA测定试剂盒,批号:20130823,均购自南京建成生物工程研究所。苦苣提取物,为深棕色浸膏,2 g生药/mL浸膏,总黄酮含量19%,由山东齐都药业有限公司加工提取,使用时以蒸馏水加热稀释至所需浓度。
二、方法
1. 运动应激性胃溃疡模型的建立:将100只Wistar大鼠随机分为5组,即安静对照组、1 h无负荷运动组、1 h负荷运动组、2 h无负荷运动组、2 h负荷运动组,每组20只,雌雄各半。各组大鼠实验前禁食8 h,自由饮水。负荷组大鼠游泳前在尾部离身体2/3处捆绑相当于体质量2%的负荷(粗铁丝),无负荷组不予处理,直接入水游泳。采用高60 cm、直径55 cm的塑料圆桶作为大鼠游泳水槽,水深50 cm,室温(25±2) ℃。水温(20±l) ℃[4]。力竭标准采用“经过10 s动物仍不能返回水面为标准”[5]。安静对照组不进行任何运动。
2. 苦苣总黄酮对运动应激性胃溃疡的干预作用:40只雄性大鼠随机分为空白对照组、1 h负荷运动模型组、大剂量苦苣总黄酮组(生药3.2 g/kg)和小剂量苦苣总黄酮组(生药1.6 g/kg),每组各10只。采用1 h负荷游泳运动建立应激性胃溃疡模型。苦苣总黄酮组大鼠运动前3 d开始灌胃给药,每日1次,共3 d,于末次给药后24 h进行游泳运动,给药体积2.0 mL/200 g体质量,其余两组给予等体积的动物饮用水。
3. 实验取材:各组模型建立实验大鼠分别于运动结束后立即处死,结扎贲门,向胃内注射5 mL 4%多聚甲醛后结扎幽门,取出全胃,放置15 min后沿胃大弯剪开,以0.9% NaCl溶液洗去胃内容物,滤纸吸干多余水分,平铺于培养皿内,观察胃黏膜损伤程度。胃黏膜损伤程度采用Guth计数法,采用胃溃疡指数(UI)表示[6]。
各组苦苣总黄酮干预实验大鼠运动结束后腹腔注射2%戊巴比妥钠0.2 mL/100 g,取下腔静脉血4 mL,分离血清;同时观察UI,并取2 g胃组织制作10%胃组织匀浆,离心,取上清液,检测黏膜和血清中SOD和MDA含量。
4. 组织病理学检查:取大鼠胃窦部置于4%多聚甲醛中固定3 d,常规脱水、石蜡包埋、切片,行HE染色,观察各组大鼠胃黏膜组织病理学改变。
5. 检测指标:采用WST-1法检测胃黏膜组织中SOD含量,于450 nm处行比色测定。采用硫代巴比妥酸测定法(thiobarbituric acid,TBA)检测胃黏膜组织和血清中MDA含量,于520 nm处行比色测定。具体步骤按试剂盒说明书操作。
三、统计学分析
结果
一、运动应激性胃溃疡模型的建立
1. 不同负荷和不同游泳时间对大鼠胃黏膜损伤的影响:安静对照组未见胃黏膜损伤,其余四组UI均较安静对照组显著升高(P<0.01)。与1 h负荷运动组相比,1 h无负荷运动组UI显著降低(P<0.01),2 h无负荷运动组无明显差异(P>0.05),2 h 负荷运动组显著升高(P<0.01);2 h无负荷运动组与2 h负荷运动组UI无明显差异(P>0.05)(表1)。
±s)
*与安静对照组比较,P<0.01;#与1 h负荷运动组比较,P<0.01;与同组雌性大鼠比较,△P<0.05,△△P<0.01
2. 不同性别对大鼠胃黏膜损伤的影响:1 h无负荷运动组、1 h负荷运动组、2 h无负荷运动组雄性大鼠UI均明显高于雌性大鼠(P<0.05);2 h负荷运动组雄性大鼠UI与雌性大鼠无明显差异(P>0.05)(表1)。
3. 胃组织病理学结果:安静对照组大鼠胃黏膜为单层柱状上皮,固有层结缔组织中充满胃底腺,未见上皮细胞变性、坏死;1 h无负荷运动组胃黏膜固有层血管扩张、充血;1 h负荷运动组胃黏膜深层上皮细胞变性、坏死,局部表层大面积出血;2 h无负荷运动组胃黏膜深层上皮细胞变性、坏死,局部可见陈旧性出血灶;2 h负荷运动组胃黏膜深层上皮细胞变性、坏死,局部可见陈旧性出血灶,固有层血管扩张、充血(图1)。
二、苦苣总黄酮对运动应激性胃溃疡的预防作用
1. 苦苣总黄酮对UI的影响:空白对照组未发现胃溃疡发生,其余各组UI均较空白对照组显著增高(P<0.01);与运动模型组相比,小剂量、大剂量苦苣总黄酮组UI均显著降低(P<0.05和P<0.01)(表2)。
2. 苦苣总黄酮对大鼠胃黏膜SOD含量以及胃黏膜和血清MDA含量的影响:与空白对照组相比,运动模型组大鼠胃黏膜SOD含量明显降低(P<0.01),胃黏膜和血清MDA含量显著升高(P<0.05)。与运动模型组相比,大剂量苦苣总黄酮组大鼠胃黏膜SOD含量显著升高(P<0.05),胃黏膜和血清MDA含量显著降低(P<0.05);而小剂量苦苣总黄酮组上述指标无明显差异(表2)。
3. 胃组织病理学结果:空白对照组胃黏膜为单层柱状上皮,固有层结缔组织中充满胃底腺,未见上皮细胞变性、坏死;运动模型组胃黏膜深层上皮细胞变性、坏死,局部表层大面积出血,余未见异常;大剂量苦苣总黄酮组胃黏膜浅层上皮细胞变性、坏死,黏膜层腺体充血水肿,未见明显出血灶,余未见异常;小剂量苦苣总黄酮组胃黏膜深层上皮细胞变性、坏死,未见明显出血灶,余未见明显异常(图2)。
讨论
运动应激性胃溃疡逐渐出现于日常生活中,尤其是运动员在进行激烈训练或比赛时很容易出现胃部不适或胃肠综合征,严重者可出现不能自身愈合的胃部疾病。因此,有必要寻找或探索较理想的运动应激性胃溃疡动物模型,来模拟人体在剧烈运动时身体的生理变化,从而为研究运动应激性胃溃疡的发生机制以及临床康复和治疗提供一个简单有效、快速的手段。
±s)
组 别例数UI胃黏膜SOD含量(U/mgprot)胃黏膜MDA含量(mgprot/mL)血清MDA含量(U/mL)空白对照组100343.8±11.3 2.1±0.3 5.2±1.1 运动模型组1020.5±1.9**297.0±10.4**3.2±0.3*9.9±1.6*小剂量苦苣总黄酮组1013.9±1.4**#323.2±9.12.8±0.47.5±0.9大剂量苦苣总黄酮组108.4±0.8**##332.5±12.5#2.2±0.3#5.2±1.4#
与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;与运动模型组比较,#P<0.05,##P<0.01
图2 苦苣总黄酮对大鼠运动应激性胃黏膜的作用(HE染色,×200)
有学者利用跑台[7]建立运动应激性胃溃疡的动物模型,但在跑台运动时需加以电刺激或发声装置使大鼠持续运动,而电刺激和声音刺激作为应激因素会干扰实验结果。为模拟人体受运动应激所致的胃部生理改变,游泳可作为简单的运动应激方式来建立模型,增加负荷的方式相对简单且不会干扰实验结果,并能缩短模型的建立时间。
本实验结果表明,四个运动组大鼠均能产生不同程度的运动应激性胃溃疡,且随着运动时间延长和运动量增加,胃溃疡程度随之加重。1 h负荷运动组UI明显高于1 h无负荷运动组,而2 h负荷运动组又明显高于1 h负荷运动组。但2 h负荷运动组大鼠在游泳过程中出现力竭现象,且实验过程中休息时间过长,休息时间大于入水时间。从组织病理学角度看,大鼠胃黏膜损伤程度依次为2 h负荷运动组>2 h无负荷运动组>1 h负荷运动组>1 h无负荷运动组,说明运动时间越长,胃黏膜受损越严重;在运动时间不变的情况下,负荷大鼠胃黏膜损伤程度较无负荷大鼠更严重。值得注意的是,2 h无负荷大鼠胃黏膜损伤程度虽较1 h负荷大鼠严重,但两组UI无明显差异,这可能是由于2 h无负荷运动组大鼠在运动过程中的休息时间远多于1 h负荷运动组。此外,对大鼠性别的比较发现,两个时间点雄性大鼠的胃溃疡程度均较雌性大鼠严重,说明在运动应激性胃溃疡的形成中存在性别差异,与文献报道[8]相一致,提示雄性大鼠对应激具有更好的敏感性,更易形成胃溃疡。故后续实验在雄性大鼠中采用1 h负荷运动建立运动应激性胃溃疡模型。在药物预防实验中,1 h负荷运动模型组较空白对照组胃黏膜损伤明显,UI、SOD和MDA含量发生明显变化,说明1 h负荷运动能在较短时间内建立大鼠运动应激性胃溃疡模型。两个实验共计30只模型大鼠均出现明显胃黏膜损伤,说明此方法有一定的可重复性,且未发生实验动物死亡现象,统计结果方差较小,说明结果较稳定。综合表明1 h负荷游泳运动可建立理想的大鼠运动应激性胃溃疡模型,具有形成时间短、稳定性较好、可重复性高等优点。
氧自由基是形成应激性胃溃疡的原因之一。氧自由基是指分子氧化还原为水的一系列单价途径中所产生的中间产物,如超氧自由基、烃自由基等。氧自由基通过攻击生物膜中多聚不饱和脂肪酸形成一系列脂质过氧化物及其降解产物MDA等,导致组织损伤,引起并加剧炎症反应。MDA是机体脂质过氧反应的最终产物,可反映组织中氧自由基含量和组织细胞受到氧自由基攻击的程度,MDA含量越高说明组织受损程度越严重。SOD活性能反映机体清除氧自由基的能力,对处于应激状态的机体具有保护作用[9]。本研究中,运动模型组大鼠胃黏膜SOD含量下降,胃黏膜和血清MDA含量升高,表明胃黏膜已受到明显的应激损伤;给予小剂量苦苣总黄酮干预后,胃黏膜SOD含量有上升趋势,胃黏膜和血清MDA含量有下降趋势,但差异均无统计学意义,说明运动造成的氧化应激有缓解的趋势,但不明显;给予大剂量苦苣总黄酮后,胃黏膜SOD含量明显上升,说明大鼠自身抵御胃黏膜损伤的能力增加,且胃黏膜和血清MDA含量显著下降,说明运动所造成的氧化应激损伤程度降低。结合UI和病理学结果,大剂量苦苣总黄酮对运动应激性胃溃疡有一定的预防作用。
综上所述,1 h负荷游泳运动可快速有效地建立大鼠运动应激性胃溃疡模型,大剂量苦苣总黄酮对运动引起的应激性胃溃疡有明显预防作用。但上述结论有待于更多研究进一步证实。
参考文献
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(2014-06-26收稿;2014-07-17修回)
Construction of Exercise Stress-induced Gastric Ulcer Model in Rats and Preventive Role of Sonchus oleraceus L. Total Flavonoids
LIZhikun1,CHUHaiping1,WANGFuwen1,2.1InstituteofMateriaMedica,ShandongAcademyofMedicalSciences&SchoolofMedicineandLifeSciences,ShandongAcademyofMedicalSciences,UniversityofJi’nan,Ji’nan(250062);2ShandongProvincialKeyLaboratoryforRareDiseases,Ji’nan
Correspondence to: WANG Fuwen, Email: wangfuwww@tom.com
Background: Exercise stress-induced gastric ulcer has received wide attention in recent years. Studies have shown that Sonchus oleraceus L. total flavonoids have anti-inflammation and anti-oxidation effect. Aims: To establish a fast, stable, repeatable exercise stress-induced gastric ulcer model in rats, and study the role of Sonchus oleraceus L. total flavonoids. Methods: One hundred Wistar rats were randomly divided into control group, 1-hour exercise no-load group, 1-hour exercise load group, 2-hour exercise no-load group and 2-hour exercise load group with half male and half female rats in each group. Model of exercise stress-induced gastric ulcer in rats was constructed by swimming exercise, gastric mucosal ulcer index (UI) and pathological changes were observed. Forty male Wistar rats were randomly divided into blank control group, 1-hour exercise load group, high-dose Sonchus oleraceus L. total flavonoids (crude drug 3.2 g/kg) group and low-dose Sonchus oleraceus L. total flavonoids (crude drug 1.6 g/kg) group, pathological changes of gastric mucosa was observed, concentrations of gastric mucosal SOD and gastric mucosal and serum MDA were determined. Results: Compared with 1-hour exercise load group, UI was significantly decreased in 1-hour exercise no-load group (P<0.01), UI was significantly increased in 2-hour exercise load group (P<0.01), and no significant difference in UI was seen between 1-hour exercise load group and 2-hour exercise no-load group (P>0.05). UI of male rats in 1-hour, 2-hour exercise no-load groups and 1-hour exercise load group was significantly higher than that of female rats (P<0.05). Compared with blank control group, gastric mucosal SOD concentration in 1-hour exercise load group was significantly decreased (P<0.01), gastric mucosal and serum MDA concentrations were significantly increased (P<0.05), all the above-mentioned indices were improved by high-dose Sonchus oleraceus L. total flavonoids (P<0.05). Conclusions: 1-hour load swimming can quickly and effectively construct an exercise stress-induced gastric ulcer model. High-dose Sonchus oleraceus L. total flavonoids show a preventive effect on exercise stress-induced gastric ulcer in rats.
Key wordsStomach Ulcer;Swimming;Sonchus oleraceus L. Total Flavonoids;Oxidative Stress
通信作者*本文,Email: wangfuwww@tom.com
DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.01.005