瑞巴派特对氯吡格雷所致人胃黏膜上皮细胞损伤的保护作用及其机制研究

瑞巴派特对氯吡格雷所致人胃黏膜上皮细胞损伤的保护作用及其机制研究

陆宏梅段兆涛张振玉*

南京医科大学附属南京医院(南京市第一医院)消化科(210006)

背景：长期服用氯吡格雷可引起胃肠道损伤。瑞巴派特是一种新型胃黏膜保护剂，其用于防治氯吡格雷相关胃黏膜损伤的疗效尚不明确。目的：探讨瑞巴派特对氯吡格雷所致人胃黏膜上皮细胞损伤的保护作用及其可能机制。方法：以氯吡格雷处理的人胃黏膜上皮细胞株GES-1作为氯吡格雷组，以氯吡格雷联合不同浓度(0.2、0.5、1.0 mmol/L)瑞巴派特预处理的GES-1细胞作为瑞巴派特组，同时设立阴性对照组。采用MTT法检测细胞增殖抑制情况；采用倒置相差显微镜观察细胞形态学变化；采用蛋白质印迹法检测三叶因子1(TFF1)、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)表达。结果：MTT法检测结果显示，瑞巴派特0.2、0.5、1.0 mmol/L组GES-1细胞增殖抑制率均显著低于氯吡格雷组(P<0.05)。倒置相差显微镜观察发现，氯吡格雷可诱导GES-1细胞损伤，而瑞巴派特可减轻氯吡格雷所致的细胞损伤。蛋白质印迹法检测结果显示，氯吡格雷组GES-1细胞TFF1蛋白表达较阴性对照组显著升高(P<0.05)；瑞巴派特0.2、0.5、1.0 mmol/L组TFF1蛋白表达均较氯吡格雷组进一步升高，且作用呈浓度依赖性(P<0.05)。氯吡格雷组GES-1细胞p-ERK1/2蛋白表达较阴性对照组显著升高(P<0.05)；瑞巴派特0.2、0.5、1.0 mmol/L 组p-ERK1/2蛋白表达均较氯吡格雷组显著降低，作用亦呈浓度依赖性(P<0.05)。结论：瑞巴派特可能通过抑制ERK信号通路上调TFF1蛋白表达，从而参与调控氯吡格雷所致GES-1细胞损伤的修复，此过程是瑞巴派特防治氯吡格雷相关胃黏膜损伤的可能机制之一。

关键词瑞巴派特；胃黏膜；上皮细胞；氯吡格雷；三叶因子1；细胞外信号调节激酶1/2

Extracellular Signal Regulated Kinase 1/2

氯吡格雷作为噻吩吡啶类抗血小板药物已广泛应用于心脑血管疾病的防治，但长期服用引起胃肠道损伤的报道亦随之增加[1-2]。近年来多采用质子泵抑制剂(PPIs)预防氯吡格雷相关胃肠道损伤，但有研究[3-4]表明PPIs预防氯吡格雷相关胃肠道损伤会导致心血管事件发生率和死亡率升高。因此，寻找其他能减轻氯吡格雷相关胃肠道损伤的胃黏膜保护剂显得尤为重要。瑞巴派特是一种新型胃黏膜保护剂，兼有保护胃黏膜和抑制炎症的双重作用，对胃炎、胃溃疡具有良好疗效[5-6]，但其用于防治氯吡格雷相关胃黏膜损伤的疗效尚不明确。本研究旨在观察瑞巴派特对氯吡格雷所致人胃黏膜上皮细胞损伤的保护作用，并对其可能作用机制进行探讨。

材料与方法

一、细胞株和主要试剂

人胃黏膜上皮细胞株GES-1由江苏省人民医院消化科馈赠。硫酸氯吡格雷购自北京诺德恒信化工技术有限公司；瑞巴派特购自湖北康宝泰精细化工有限公司；MTT购自美国Sigma公司；兔抗人磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)单克隆抗体购自南京凯基生物科技发展有限公司；兔抗人三叶因子1(TFF1)单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司。

二、实验方法

1. 细胞培养：将GES-1细胞置于DMEM培养基(含15%胎牛血清，pH 7.4)中，于37 ℃、5% CO2温箱内培养，隔天更换培养液，每3 d按1∶3比例传代。

2. 实验分组：取对数生长期GES-1细胞，以每孔1×105个加入96孔培养板，每孔体积200 μL，培养24 h，吸出培养液，氯吡格雷组加入含50%抑制浓度(IC50)氯吡格雷(0.36 mmol/L)[7]的培养液200 μL，瑞巴派特组分别以不同浓度(0.2、0.5、1.0 mmol/L)瑞巴派特预处理2 h，再加入含IC50氯吡格雷(0.36 mmol/L)的培养液200 μL。每组设4个复孔，同时设不予药物干预的阴性对照组。

3. MTT法检测细胞增殖抑制情况：取阴性对照组、氯吡格雷组以及0.2、0.5、1.0 mmol/L瑞巴派特组细胞，培养24 h，每孔加入MTT 50 μL，继续培养4 h，弃上清液，每孔加入DMSO 150 μL，室温避光振荡10 min，以空白孔调零，于酶标仪490 nm波长处读取吸光度(A)值。细胞增殖抑制率(%)=(1-实验组A值/阴性对照组A值)×100%。

4. 倒置相差显微镜观察细胞形态：取阴性对照组、氯吡格雷组以及0.2、0.5、1.0 mmol/L瑞巴派特组细胞，于倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化。

5. 蛋白质印迹法检测TFF1、p-ERK1/2蛋白表达：取阴性对照组、氯吡格雷组以及0.2、0.5、1.0 mmol/L 瑞巴派特组细胞，加入蛋白裂解液，4 ℃裂解，14 000 r/min离心15 min，取上清液(总蛋白提取物)，以BCA法测定蛋白浓度。取蛋白样品上样，行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭后加入TFF1抗体(1∶1 000)、p-ERK1/2抗体(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，加入HRP标记的二抗，孵育后ECL法显色，以Gel-Pro Analyzer软件分析电泳条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参照β-actin条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

三、统计学分析

结果

一、细胞增殖抑制情况

MTT法检测结果显示，阴性对照组、氯吡格雷组、瑞巴派特0.2、0.5、1.0 mmol/L组GES-1细胞增殖抑制率分别为(3.56±0.50)%、(49.15±2.97)%、(38.52±2.84)%、(29.88±3.29)%和(14.20±3.42)%。氯吡格雷组细胞增殖抑制率显著高于阴性对照组(P<0.05)，不同浓度瑞巴派特组细胞增殖抑制率均显著低于氯吡格雷组(P<0.05)。

二、细胞形态学变化

倒置相差显微镜观察显示，阴性对照组GES-1细胞呈梭形，均一贴壁生长；氯吡格雷组贴壁细胞数量较阴性对照组减少，部分细胞变圆，悬浮，细胞核浓缩；不同浓度瑞巴派特组贴壁细胞数量均较阴性对照组减少，有不同程度的细胞损伤，但损伤细胞 数量与氯吡格雷组相比有所减少，瑞巴派特1.0 mmol/L 组细胞损伤最轻(图1)。

阴性对照组GES-1细胞有一定程度的ERK1/2磷酸化，氯吡格雷组p-ERK1/2蛋白相对表达量较阴性对照组显著升高(P<0.05)，瑞巴派特0.2、0.5、1.0 mmol/L组p-ERK1/2蛋白相对表达量均较氯吡格雷组显著降低(P<0.05)，作用亦呈浓度依赖性(P<0.05)(图3)。

A：阴性对照组；B：氯吡格雷组；C：瑞巴派特0.2 mmol/L组；D：瑞巴派特0.5 mmol/L组；E：瑞巴派特1.0 mmol/L组

图1倒置相差显微镜下各组GES-1细胞形态学表现(×200)

三、TFF1和p-ERK1/2蛋白表达

蛋白质印迹法检测结果显示，氯吡格雷组GES-1细胞TFF1蛋白相对表达量较阴性对照组显著升高(P<0.05)；瑞巴派特0.2、0.5、1.0 mmol/L组TFF1蛋白相对表达量均较氯吡格雷组进一步升高(P<0.05)，且作用呈浓度依赖性(P<0.05)(图2)。

1 Da=0.992 1 u

A：阴性对照组；B：氯吡格雷组；C：瑞巴派特0.2 mmol/L组；D：瑞巴派特0.5 mmol/L组；E：瑞巴派特1.0 mmol/L组

图2各组GES-1细胞TFF1蛋白相对表达量(蛋白质印迹法)

A：阴性对照组；B：氯吡格雷组；C：瑞巴派特0.2 mmol/L组；D：瑞巴派特0.5 mmol/L组；E：瑞巴派特1.0 mmol/L组

图3各组GES-1细胞p-ERK1/2蛋白相对表达量(蛋白质印迹法)

讨论

瑞巴派特具有促进动物和人胃黏膜黏液分泌，提高胃黏膜表层黏液总量和可溶性黏液量，增加黏膜内前列腺素E2(PGE2)含量和胃黏膜血流量，促进胃黏膜上皮细胞增生和成熟，从而增强胃黏膜防御功能的作用[8-9]。研究表明，瑞巴派特对乙醇[10]、非甾体消炎药(NSAIDs)[11]、幽门螺杆菌(Hp)感染[12]等损伤因子引起的胃肠道损伤均具有一定保护作用，可促进胃黏膜修复再生，提高胃黏膜屏障功能。然而，目前关于瑞巴派特防治氯吡格雷相关胃肠道损伤的研究报道尚少。本研究采用MTT法结合倒置相差显微镜观察分析氯吡格雷和瑞巴派特对人胃黏膜上皮细胞株GES-1增殖的影响，结果显示氯吡格雷可抑制GES-1细胞增殖，导致细胞损伤，而给予瑞巴派特预处理能显著减轻氯吡格雷引起的GES-1细胞增殖抑制和损伤。

TFF1是三叶肽家族成员之一，又名乳癌相关肽(pS2)，是一类小分子蛋白肽，于1982年由Masia-kowski等[13]在雌激素诱导的人乳腺癌细胞株MCF-7中获得，主要表达于胃黏膜小凹和上皮。研究表明TFF1是一种保护因子，在胃黏膜保护中发挥重要作用，参与黏液屏障组成，促进细胞迁移和损伤修复[14-15]。其机制可能为：与黏液中的糖蛋白结合形成稳定的凝胶复合物，加强黏液凝胶层，从而加固碳酸氢盐屏障，减少胃腔表面有害物质以及机械应力等因素对黏膜的损伤[16-17]。研究[18-19]证实，发生急性胃黏膜损伤时，TFF1表达增强以促进损伤修复。提前或同时口服TFF1能防治阿司匹林引起的大鼠胃溃疡，使胃溃疡指数不同程度地下降[20]。莫喜晶等[21]在研究七方胃痛颗粒对Hp感染人胃腺癌细胞中TFF1表达的影响时发现，七方胃痛颗粒浓度越高，保护作用越强，TFF1蛋白表达量越高。上述研究表明，急性胃黏膜损伤时，机体可通过上调TFF1蛋白表达修复胃黏膜，而给予胃黏膜保护剂后，TFF1蛋白表达可进一步上调，对胃黏膜损伤的修复作用亦显著增强。

本研究同时观察了瑞巴派特预处理对氯吡格雷作用下GES-1细胞TFF1表达的影响。研究采用蛋白质印迹法检测GES-1细胞TFF1蛋白表达的变化，结果显示与阴性对照组相比，氯吡格雷组TFF1蛋白表达显著上调，而给予瑞巴派特预处理的GES-1细胞随着瑞巴派特浓度的增加，TFF1蛋白表达较氯吡格雷组进一步升高且作用呈浓度依赖性，推测氯吡格雷诱导GES-1细胞损伤，使TFF1表达代偿性升高，而瑞巴派特在减轻氯吡格雷引起的细胞损伤的同时，使TFF1表达进一步升高，以促进损伤黏膜修复，这可能是瑞巴派特防治氯吡格雷相关胃黏膜损伤的机制之一。目前瑞巴派特上调TFF1表达的具体机制尚不明确，有学者[22]指出TFF1的激活依赖于RAS和ERK1/2的激活，由此推测TFF1表达上调可能与ERK信号通路有关，本研究对此推测进行了验证。

ERK是MAPK家族成员之一，主要分为ERK1和ERK2，统称为ERK1/2，相对分子质量分别为44 kDa 和42 kDa[23]。多种细胞外信号均可促使ERK信号通路激活，活化的ERK进一步激活下游核转录因子，引起特定蛋白表达和活性改变[24]。本研究结果显示，氯吡格雷组GES-1细胞TFF1和p-ERK1/2蛋白表达均较阴对照组显著升高，如给予瑞巴派特预处理，TFF1和p-ERK1/2蛋白表达分别以浓度依赖性的方式上调和下调，提示瑞巴派特可能通过抑制ERK信号通路上调TFF1蛋白表达，从而有效减轻氯吡格雷引起的GES-1细胞损伤。

综上所述，瑞巴派特可能通过抑制ERK信号通路上调TFF1蛋白表达，从而参与调控氯吡格雷所致GES-1细胞损伤的修复，此过程是瑞巴派特防治氯吡格雷相关胃黏膜损伤的可能机制之一。

参考文献

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(2014-08-15收稿；2014-09-02修回)

·论著·

Protective Effect and Mechanism of Rebamipide on Human Gastric Mucosal Epithelial Cell Injury Induced by Clopidogrel

LUHongmei,DUANZhaotao,ZHANGZhenyu.DepartmentofGastroenterology,NanjingFirstHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing(210006)

Correspondence to: ZHANG Zhenyu, Email: zzy6565@sina.com

Background: Long-term use of clopidogrel may cause gastrointestinal injury. Rebamipide is a novel mucoprotective drug, however, its protective effect on gastric mucosal injury induced by clopidogrel has not been clarified. Aims: To investigate the protective effect and potential mechanism of rebamipide on human gastric mucosal epithelial cell injury induced by clopidogrel. Methods: In clopidogrel group, human gastric mucosal epithelial cell line GES-1 was treated with clopidogrel; GES-1 cells in rebamipide group were pretreated with different concentrations of rebamipide (0.2, 0.5 and 1.0 mmol/L) before clopidogrel treatment, and a negative control group was established simultaneously. Inhibition of cell proliferation was measured by MTT assay. Morphological change of cell was observed by inverted phase contrast microscope. Expressions of trefoil factor family 1 (TFF1) and phosphorylated extracellular signal regulated kinase 1/2 (p-ERK1/2) were determined by Western blotting. Results: MTT assay showed that cell proliferation inhibition rates of GES-1 cells in rebamipide 0.2, 0.5 and 1.0 mmol/L groups were significantly lower than that in clopidogrel group (P<0.05). Injury of GES-1 cells was seen in clopidogrel group by inverted phase contrast microscope and rebamipide could reduce the cell injury. Expression of TFF1 in GES-1 cells in clopidogrel group was significantly higher than that in negative control group (P<0.05), while those in rebamipide 0.2, 0.5 and 1.0 mmol/L groups were further increased in a dose-dependent manner as compared with that in clopidogrel group (P<0.05). Expression of p-ERK1/2 in GES-1 cells in clopidogrel group was significantly higher than that in negative control group (P<0.05), while those in rebamipide 0.2, 0.5 and 1.0 mmol/L groups were significantly lower than that in clopidogrel group in a dose-dependent manner (P<0.05). Conclusions: Rebamipide has a protective effect on GES-1 cells injury induced by clopidogrel, probably through inhibiting ERK signaling pathway, up-regulating TFF1 expression and promoting mucosal healing.

Key wordsRebamipide;Gastric Mucosa;Epithelial Cells;Clopidogrel;Trefoil Factor Family 1;

通信作者*本文，Email: zzy6565@sina.com

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.01.003