联合检测血浆SFRP2、RNF180基因甲基化在胃癌临床诊断中的价值*

宋毓飞 张 谢 孙蓓蕾 张学松 黄诗良 黄志刚

宁波市医疗中心李惠利医院消化内科(315040)

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年因胃癌死亡的患者约73.8万例，总体5年生存率仅约20%，是一种严重威胁人群身体健康的疾病［1-2］。目前胃癌的诊断金标准仍为内镜下取活检的病理结果，尚缺乏理想的非侵入性检查手段。早期胃癌无特异性症状，导致许多患者未能及时就诊治疗，漏诊率高。寻找并开发痛苦小且准确性高的筛查方法(如血液检查)对提高胃癌早期诊断率和5年生存率非常重要。

近年来，研究发现DNA异常甲基化是肿瘤发生、发展过程中主要的基因学改变，且此改变发生在胃癌早期阶段［3-4］。本研究通过应用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR，MSP)法检测胃癌患者和对照者血浆中肿瘤凋亡相关因子SFRP2［5］和RNF180［6］基因启动子区甲基化状态，旨在评估这两种基因在胃癌发生、发展中的作用，以期为胃癌早期诊断以及筛查提供新的非侵入性方法，从而改善胃癌的5年生存率。

材料与方法

一、临床资料

收集2011年6月-2013年6月浙江省宁波市医疗中心李惠利医院胃小肠外科67例胃癌患者的血浆标本，其中男42例，女25例，年龄31～89岁，中位年龄62岁。纳入条件:①患者术前均经胃镜活检确诊为胃癌，术后经病理切片再次确诊;②患者术前均未接受过任何放、化疗;③术前无其他肿瘤病史。全部病例均按WHO标准和国际抗癌联盟TNM系统(2010年)标准进行组织病理分型。另收集同期51名正常健康体检者的血浆标本作为对照，其中男30名，女21名，年龄30～81岁，中位年龄56岁。本研究方案获得宁波市医疗中心李惠利医院伦理委员会同意，所有胃癌患者和健康志愿者均签署知情同意书。

二、研究方法

取受试者周围静脉血3 mL，置于EDTA处理过的抗凝管中，3 000×g离心15 min，取上清，标记，置于－80℃低温冰箱保存备用。

1.DNA 提取:每份血浆标本取 400 μL，按照QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen)说明书提取DNA，最终以80 μL AE洗脱液洗脱，存于－20℃冰箱备用。

2.DNA 修饰:取 2 μg DNA，按照 EpiTect Bisulfite Kit(Qiagen)说明书操作。经亚硫酸盐处理后，DNA中未甲基化的胞嘧啶(C)转变成尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶则保持不变，修饰后的DNA用30 μL EB重新溶解，用于MSP检测。

3.MSP法:设计 MSP引物序列(表1)。PCR反应体系总体积共为50 μL，内含2 μL DNA样品，10 μL 缓冲液(Kapa Biosystems)，1 μL 10 mmol/L dNTP(Kapa Biosystems)，上下游引物(150 mmol/L)各 1 μL，0.5 U Taq 酶(Kapa Biosystems)0.2 μL，超纯水34.8 μL。扩增条件:95℃预变性5 min;95℃30 s，Tm+8℃(Tm 为 DNA解链温度)30 s，72℃1 min，共10个循环;95 ℃ 30 s，Tm ℃ 30 s，72 ℃1 min，共38个循环;最后72℃延伸7 min。PCR扩增结束后，产物行2.5%琼脂糖凝胶电泳(含溴化乙锭0.5 μg/mL)鉴定，每孔加样量 10 μL，电泳缓冲液为1×TAE。电泳结束后，紫外检测仪下观察并拍照。

表1 SFRP2［7］、RNF180 MSP 甲基化引物序列

甲基化判定:PCR产物出现甲基化条带而不出现非甲基化条带的样品，判定为基因甲基化;出现非甲基化条带而不出现甲基化条带的样品，判定为基因非甲基化;甲基化条带和非甲基化条带均出现的样品，判定为基因甲基化。

三、统计学分析

应用SPSS 13.0统计软件，计数资料的比较采用χ2检验或Fisher精确检验法。用多因素Logistic回归法分析2个基因甲基化预测胃癌的能力。优势比(OR)和95%CI用于分析各基因甲基化间的关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、血浆SFRP2、RNF180基因甲基化表达

对照组和胃癌患者血浆中SFRP2基因启动子区甲基化发生率分别为37.3%(19/51)和67.2%(45/67)，组间差异有统计学意义(P＜0.01);RNF180基因启动子区甲基化发生率分别为23.5%(12/51)和53.7%(36/67)，组间差异有统计学意义(P ＜0.01)(图1)。

图1 SFRP2、RNF180基因MSP电泳图

二、SFRP2、RNF180基因异常甲基化与临床病理特征相关性

胃癌患者血浆SFRP2基因启动子区甲基化发生率与性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴结转移、远处转移均无相关性(P＞0.05)(表2);RNF180基因启动子区甲基化发生率与性别、年龄无关(P＞0.05)，但与肿瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴结转移、远处转移均显著相关(P＜0.01)(表2)。

表2 胃癌患者血浆SFRP2、RNF180基因甲基化率与临床病理特征的相关性(n)

三、SFRP2、RNF180甲基化预测胃癌能力以及两者联合诊断胃癌的能力

Logistic回归显示，RNF180基因异常甲基化水平(OR=3.0，95%CI:1.3 ～7.0，P ＜0.01)对胃癌的预测能力稍优于SFRP2基因(OR=2.7，95%CI:1.2～6.1，P ＜0.01)。胃癌患者能检测到 SFRP2 或RNF180基因甲基化水平的敏感性、特异性分别为77.6%和54.9%，而同时检测到两种基因甲基化的敏感性和特异性分别为42.7%和88.2%，OR值为5.6(95%CI:2.1 ～14.8)，说明两种基因联合检测能提高胃癌临床诊断率，优于任一基因的单独检测(表3)。

讨 论

20余年前，Shapiro等［8］发现消化道恶性肿瘤患者血清中游离DNA含量明显高于良性病变患者［(412±63)ng/mL对(118±14)ng/mL］。近年来，通过对这些游离DNA的研究发现了许多与肿瘤发生相关的遗传学改变，如基因甲基化、基因点突变、微卫星不稳定现象等，其中DNA异常甲基化是肿瘤发生、发展过程中主要的基因学改变［4，8］。DNA甲基化能关闭某些基因活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达，DNA甲基化的改变可通过影响癌基因和抑癌基因的表达而参与癌症的发生，这为通过检测血浆DNA甲基化状态来筛查早期胃癌提供了可能。

在胃癌患者术后组织中已发现许多甲基化状态异常的基因。DNA修复基因hMLH1与胃癌患者术后不良预后相关，其在胃癌组织中的甲基化率明显高于远处正常组织(5.7%对0%)［9］。p16可抑制细胞周期进展，与肿瘤分化、淋巴结转移和术后生存率密切相关，Wu等［10］发现胃癌的甲基化率明显高于癌旁正常组织(85.9%对12.0%)。RUNX3为RUNX转录家族成员，与肿瘤浸润程度、淋巴结转移和远处转移密切相关，Zhang等［11］的研究显示胃癌组织RUNX3甲基化率为57.6%，甲基化患者中RUNX3表达明显低于非甲基化患者。DAPK是正向调节细胞凋亡因子，与肿瘤分化程度、淋巴结转移密切相关，其在胃癌组织中的甲基化率高于正常组织(12.8% 对 2.7%)［12］。SFRP2 为肿瘤抑制因子，与临床特征无相关性，其在胃癌组织中的甲基化率明显高于正常组织［5，7，13］。RNF180 是最新发现的肿瘤抑癌因子，目前国内外还少有其与临床特征相关性的报道，Cheung等［14］发现胃癌组织中RNF180甲基化率明显高于正常组织(76%对0%)，但该研究例数很少，有待进一步证实。

本研究前期对上述6个基因进行了甲基化预实验筛查，结果显示联合检测血浆中肿瘤抑制因子SFRP2和RNF180基因甲基化水平对胃癌的临床诊断价值最高。SFRP2通过基因启动子区甲基化使基因沉默，从而激活Wnt/β-catenin信号转导途径，此信号途径与包括胃癌在内的多种肿瘤发生密切相关［7，15］。本研究结果显示胃癌中 SFRP2基因敏感性和特异性分别为67.2%、62.8%，SFRP2甲基化水平与临床病理特征无相关性。

环指蛋白RNF180是膜结合的E3泛素连接酶，包含RING finger和卷曲螺旋结构域，与细胞增殖、分化以及肿瘤形成密切相关［14，16］。有研究发现RNF180 mRNA以及蛋白表达在胃癌细胞株、胃癌组织中下调或消失，且此现象在其他消化道系统癌症中未发现，提示RNF180可能是一种新的胃癌特异性肿瘤抑制因子［14］。本研究首次探讨了血浆中RNF180甲基化表达水平与胃癌患者临床资料以及病理特征的相关性，结果显示胃癌患者血浆中RNF180甲基化率显著高于正常健康者，且与肿瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴结转移、远处转移等相关，提示其与胃癌预后密切相关;RNF180诊断胃癌的特异性较高，但敏感性较低，与SFRP2联合可提高其临床诊断率，联合检测胃癌血浆SFRP2、RNF180的OR值最高，优于任一基因单独检测。

表3 SFRP2、RNF180基因甲基化联合检测诊断胃癌的能力

综上所述，从血浆中寻找基因启动子区异常甲基化的特异性肿瘤标志物，对胃癌临床诊断和预测有积极的意义。本研究结果显示，利用MSP联合检测血浆SFRP2和RNF180基因甲基化，可作为微创检测方法，有望成为新的辅助胃癌诊断和筛查的分子生物学指标。本研究所采用的MSP为定量方法，后续实验会根据前期结果，对SFRP2和RNF180进行焦磷酸测序，进一步验证联合检测血浆中SFRP2和RNF180基因甲基化水平作为胃癌非侵入性早期筛查的可行性和可信性。

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