髓系肿瘤克隆演变的研究进展

苟 阳，杨武晨，杨 程 综述，彭贤贵 审校

（第三军医大学新桥医院血液科，重庆400037）

血液系统肿瘤包括髓系和淋系两大类，最常见的髓系肿瘤有骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferative neoplasm，MPN），骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）和急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）等。环境、年龄、机体本身等因素作用使得细胞的分化阻滞、异常增殖发生在机体造血的不同阶段，引起不同血液系统肿瘤亚型的产生。近年来，随着二代测序［1］，单细胞分析技术［2］，基因芯片，基因表达谱分析等基因分析技术及异种移植技术等动物实验技术［3］的成熟应用，肿瘤细胞的基因特征、基因表达变化过程和致病特征已经越来越清晰。关于肿瘤基因相关致病机制的研究主要有肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）［4］和克隆演变理论［5］，本文将重点阐述克隆演变理论在髓系肿瘤发病机制中的应用。

1 克隆演变理论基础

Nowell［6］在1976年首先提出肿瘤是由多步骤的体细胞突变形成，经过不断克隆选择的一个进化的过程，以后的众多研究也证实了这一点［7-8］。细胞在不断的分裂过程中，都有可能发生基因突变，发生突变的细胞与未发生突变的细胞对环境的适应能力不一样，适应力强的细胞优势生长，某种基因突变赋予细胞的生存优势可用适应度值定量，适应度值越大，越利于细胞生长。Bozic等［9］用公式估计当肿瘤中某种突变的适应度大于0.4%时，这个突变即为主导突变，其余的为过客突变。同一个细胞克隆具有相同的生长能力，细胞生长过程中多个主导突变的系列出现则可能产生多个细胞克隆群体。若最终的细胞克隆依次来源于相同的母细胞，则为线性克隆演变模式；若来源于不同的母细胞，则为分支模式。

移植的成功首先证实了造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）的存在，造血也自此被描述为是由HSC 不断分化、发育、成熟为各系的造血前体细胞及各阶段的成熟细胞的过程。在造血过程中，若随机发生的某种突变在某种环境中的适应度值大，则可能导致某个克隆群体的过度生长。当这种基因突变发生在仅有增殖能力（如成熟细胞）的细胞上时，这些突变将随着细胞死亡而丢失；但如果该种基因突变能使细胞的自我更新能力增加或发生在有自我更新能力的细胞上（如HSC 和造血前体细胞），则具有突变的细胞群体会不断壮大，正常细胞群体不断缩小，最终导致肿瘤形成。

2 髓系肿瘤的克隆演变

二代测序可通过VAF值［10］及Miller等［11］分析方法直接判断样本中的细胞克隆数，通过细胞表面标志分离特定的细胞类型结合体外培养单克隆技术，单细胞技术等对初诊与复发的、慢性与急性的髓系肿瘤，以及MDS与AML 前后的样本基因组进行比较分析等，都可得到肿瘤的克隆演变情况，更多的遗传学上的克隆分析方法也在越来越多地应用到肿瘤的研究中［5］。

2.1 髓系肿瘤的克隆结构 在各种髓系肿瘤中，AML平均基因突变数最多，MDS次之，MPN 最少，分别约为13.0、1.8、0.6个突变／样本［12-14］。基因突变随着细胞分裂而发生，众多的基因突变类型决定了最终肿瘤多克隆的存在（不同的细胞克隆基因突变类型不一样）。克隆结构最复杂为AML，MDS 次之，MPN 最简单。200个AML患者中超过50%有1个主克隆和1～3个亚克隆［12］；在313个具有2个以上突变的MDS患者中，62%的患者为单克隆，34%有亚克隆存在［15］；大部分MPN患者只有1个基因突变，为单克隆的存在［14］。

2.2 髓系肿瘤的克隆演变模式 在多克隆存在的情况下，AML、MDS和MPN 均有线性克隆演变模式和分支模式。有研究证明1个MDS患者中仅存在线性模式［16］。在6个双克隆MDS中，3个样本中CD34-细胞的基因突变与CD34＋细胞的突变相同，说明这些CD34-细胞由突变的CD34＋细胞来源，而另外有3 个则不是，证明线性模式与分支模式均存在［17］。在8个具有多基因突变的MPN 中，4个为线性模式，4个为分支模式，且其基因突变克隆演变图可以被完整描绘出［14］。AML的转化与复发也与克隆状态有关。对7个MDS和转化的AML 比较说明AML 的转化与1个亚克隆的过度生长有关［18］。AML复发后与复发前对比分析说明AML 的复发可能为主要克隆增加额外突变，或亚克隆增加突变进展导致［19-21］。

2.3 髓系肿瘤的克隆演变原因及发病机制 不同的突变基因在不同环境下的不同增殖优势导致不同的肿瘤克隆形成。多克隆结构的存在取决于多种优势基因突变类型的先后出现，若突变赋予的细胞的生长优势强，则细胞倾向于线性增长模式，若2个基因突变赋予细胞的生长优势都不是很强，则可能导致分支结构的产生［5］。通常不能事先知道某种基因突变在某种环境中赋予的细胞的增殖优势有多大，但可以通过肿瘤的克隆结构与相应突变基因的功能推测这些基因突变的作用大小。

2.3.1 具有决定性意义的基因突变 极小部分髓系肿瘤有特异的基因突变，如BCR-ABL、AML1-ETO、MLL-AF9、NUPHOXA9、PML-RARα，对于这些肿瘤和基因研究最为清楚。将含有这些特定基因突变的细胞植入免疫抑制的小鼠体内能直接诱导小鼠类似人类相应白血病的产生［22-24］，这些特定的基因突变往往决定着细胞重要的生化反应过程。而直接诱导小鼠白血病产生的具有特定基因突变的细胞类型可以是CD34＋CD38-的细胞［25］，也可能是CD34＋CD38＋和CD34-细胞，或者它们的混合物［26］，说明即使是一些很关键的基因突变也不是单独存在于HSC 上就能引起白血病，还需要后期突变和后期细胞的参与。小鼠模型中2个基因突变比单个突变能更快更高地植入引起AML 的产生［27-29］，持续缓解患者体内AML1-ETO 持续存在，但需要其他基因的参与才能引起发病［30］，这些事实也说明了上述观点。但是这些肿瘤的克隆结构一般都比较简单。

在慢性髓系白血病（chronic myeloid leukemia，CML）和AML-M3中，BCR-ABL 和PML-RARα的突变均发生在HSC上［29］。可以推测，由于PML-RARα基因的表达对早幼粒细胞的分化阻滞影响较大，故最终肿瘤中有大量早幼粒细胞异常的克隆群体；而BCR-ABL基因的表达对细胞的分化阻滞影响不大，而可以促进各阶段粒细胞的过度增殖，故最终肿瘤中各阶段粒细胞数都特别多。

2.3.2 克隆演变基因改变的出现顺序 大部分的白血病无法由基因突变的细胞直接诱导产生，一个患者常具有多种不太特异的基因突变类型，髓系肿瘤基因突变类型根据功能大概分为几大 类［12］，信 号 途 径 成 分：如ABL、CBL、FGFR1、FLT3、JAK2、KIT、LNK、MPL、PDGFR、PTPN11、RAS；转录因子：如CEBPA、GATA2、RARA、IKZF1、RUNX1、ETV6、NPM1；表观遗传学调控基因：如ASXL1、MLL、DNMT3A、EZH2、TET2、SUZ12、MYST3、UTX；抑癌基因：如TP53、WT1、CDKN2A；剪接体成分：如SF3B1、SRSF2、U2AF1、ZRSR2；其余少量分类不是很明确。

同一功能类基因突变一般不同时出现，如信号途径突变的基因常不同时出现，但表观遗传学中ASXL1和EZH2，TET2等突变可同时出现；不同类基因突变常同时出现，信号途径基因突变和表观遗传学基因突变、表观遗传学基因突变和剪接体成分相关基因突变常同时出现，如CBL／KIT 常出现在CBF AML 中，DNMT3A 和FLT3、NPM1同时出现，U2AF1 和ASXL1同时出现［31］。

在众多的基因突变类型和突变细胞中，很重要的一点就是寻找起始突变或早期突变。起始突变与白血病细胞克隆的演变及后期突变的获得密切有关。具有一些重要的早期突变的HSC或前体造血细胞也被称为白血病前干细胞［32-33］。表观遗传学相关突变是早期突变中比较重要的一种。（1）调节甲基化状态的甲基化相关基因，如IDH1／2，DNMT3A，EZH2，ASXL-1作为早期突变出现的频率比较大［34］；（2）在HSC的基因突变类型中，表观遗传学的改变速度比基因改变的速度要高几个数量级［31］；（3）CPG 的甲基化与去甲基化状态、组蛋白甲基化、染色体构象改变等可直接广泛影响多种基因的表达；（4）甲基化相关基因缺失的小鼠模型都表现出了细胞增殖能力增强［35-38］，这可以赋予突变细胞一个生存优势。

表观遗传学相关基因改变常为早期突变，但也可为晚期突变，其余各类基因突变的出现顺序不十分明确。AML患者中，FLT3-ITD常为晚期出现的突变，而NPM1、TET2、SKP2、SMC1A 等可能为早期突变［33］；MPN 中，TET2、DNMT3A 先于JAK2V617F突变出现，IDH1后出现，CALR为早期突变［39］；MDS患者中，SF3B1和GATA2基因突变先于TET2和EZH2突变的出现［40］。

基因突变的出现是随机的，环境因素决定哪些基因突变可以被选择保留，后出现的突变可被先出现的突变驱使产生，起始突变尤为重要，而多克隆的出现源于每一步出现的突变的几种可能性，决定总共需要几个这样的突变和可能的组合很重要［31］。

3 总 结

众多的肿瘤学研究证实肿瘤是一个符合达尔文自然选择理论的一个多步骤进化演变过程［5-8］。在多种肿瘤中，髓系肿瘤的基因突变数最少［41］，克隆演变过程也最简单。不同的突变基因在不同环境下的不同增殖优势致使不同的肿瘤克隆形成。突变基因对细胞生理生化特性影响大，相应肿瘤的产生将有一个快速和简单的克隆演变过程，反之较复杂［42］。起始于HSC上的某些个特异的基因突变如BCR-ABL、PML-RARA、AML1-ETO、MLL重排等对细胞增殖分化影响比较大，与特定的已知的髓系肿瘤亚型直接相关，且多为单克隆结构。JAK2突变、CALR 突变和MPL突变可通过影响共同的JAKSTAT 信号途径来导致MPN 的形成［43］，也多为单克隆结构。大部分的AML及MDS没有特异的基因突变，但多有前述五大类基因突变中的一类或几类。各类基因突变对细胞的生理生化功能的影响强弱不一样，在不同个体中出现的先后顺序不一样，在同一肿瘤中出现的克隆群体也可能不一样，相对而言，表观遗传学改变相关基因多可出现在克隆演变早期［33-34］。信号途径改变（JAK2-STAT 以外的）、转录因子及表观遗传学改变常伴随且高频出现在AML 中，常为多克隆结构；剪接体相关突变及甲基化相关基因突变在MDS和慢性粒单核细胞白血病（chronic myelomonocytic leukemia，CMML）中出现频率很高，与其病态造血及增殖优势密切相关［44］，可为多克隆结构。

CML、AML-M3等基因突变和克隆结构简单的肿瘤通过突变基因药物靶向治疗，可以取得很好的疗效；而对于多克隆多基因突变的肿瘤细胞群体来说，针对于含有某种基因突变的某个细胞克隆群体的靶向治疗将不能达到良好疗效。相反，一个克隆群体的杀灭将利于另一个克隆群体的增长，导致耐药的产生。因而，刻画出每个患者的基因突变的肿瘤细胞的克隆进化图，将利于最终真正有针对性地进行每个患者的靶向治疗。

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