脐血间充质干细胞临床应用进展

谢新林综述，杨云华审校

（南华大学附属第一医院儿科，湖南衡阳421001）

脐血间充质干细胞临床应用进展

谢新林综述，杨云华审校

（南华大学附属第一医院儿科，湖南衡阳421001）

干细胞； 细胞移植； 心肌炎； 综述

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植是目前治疗心血管疾病、自身免疫性疾病及恶性肿瘤的主要手段之一，而脐血作为MSCs的重要来源之一，较骨髓中采集的MSCs更具有易于采集、来源广泛、自我更新、免疫调控、向不同组织分化潜能、促进微血管形成及被病原体污染可能性小等优点[1]，广泛应用于组织工程、细胞治疗等领域。脐血间充质干细胞（umbilicalcord blood mesenchymal stem cells，UCB-MSCs）表达MSCs表面标志物，如CD105、CD166、CD90及CD73，不表达造血细胞标志物，如CD45、CD34、CD14和CD19等，中等表达组织相容性复合体-Ⅰ（histocompatibility complex-Ⅰ，MHC-Ⅰ），低表达或不表达组织相容性复合体-Ⅱ（histocompatibility complex-Ⅱ，MHC-Ⅱ）类分子，具有不被受体免疫系统所识别、移植物抗宿主病极少见、无人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）配型问题等优点。越来越受到高度关注。大量实验动物研究和临床前期试验结果均显示，UCB-MSCs移植优势明显[2]。本文就近年来UCB-MSCs的来源、分化、归巢、免疫调控及其在脑梗死、脑出血、脊髓损伤等中的作用和临床前期应用进展作一综述，同时讨论其临床应用的可能性。

1 MSCs的定义

MSCs是一类具有自我更新、向不同组织分化、免疫调节功能的多潜能基质细胞[3]。体外培养的MSCs缺乏特异性和独特的细胞标志，目前，只能通过组合表型标志和功能特性对其定义。现在普遍认为，MSCs不表达造血细胞标志物，如CD14、CD34和CD45或共刺激分子CD80、CD86和CD40，表达不同水平的CD73、CD90、CD105、CD44、CD71和CD271。这些标志物通常受种类、组织来源、特异性培养和实验条件的不同影响可以有较大水平的差异。

2 MSCs的来源

MSCs广泛存在于胎儿和成年人的各种组织和脏器中，包括骨、软骨、脂肪、外周血和肌肉等不同组织，骨髓组织中虽然含量最为丰富，但骨髓中的MSCs仅占骨髓细胞的0.01%～1.00%，并随年龄增长而减少。与骨髓比较，大量实验已证实，脐血中所含的MSCs更加原始，因而有更强的增殖、分化能力。另外，UCB-MSCs具有低免疫源性，低表达或不表达MHC-Ⅰ或MHC-Ⅱ类分子。使其对HLA配型不符有更大程度的耐受性，移植后受体的排斥反应发生率和严重程度较骨髓低[4]。大多数时候，脐血作为医疗废物被丢弃，因而脐血具有来源广泛、收集便捷且不受法律及伦理制约的担忧，使得脐血成为继骨髓外的另一个MSCs重要来源。

3 MSCs具有多向分化潜能

3.1 MSCs向中胚层分化 MSCs来源于中胚层，大量研究证实，定向诱导MSCs可分化为各种中胚层组织细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌组织等。鞠秀丽等[5]将 UCB-MSCs接种于绒毛膜支架后放置于含10 mmol/L地塞米松、10 nmol/L 1，25二羟基维生素D3、10%胎牛血清、50 g/L抗坏血酸和10 mmol/L β-甘油磷酸的高糖型DMEM培养液中，经3、4周培养在电镜下观察到大量覆盖于支架表面的细胞外壳，通过检测成骨细胞碱性磷酸酶活性和Ca2+浓度证实，人UCB-MSCs能分化为成骨细胞。诸多研究表明，含抗坏血酸、地塞米松、胰岛素、亚硒酸、转铁蛋白及10 μg/L转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）的基础培养液可诱导MSCs向软骨细胞分化。胞内信号途径和smads信号途径被激活后可诱导特异转录因子——Sox6、Sox5、Sox9，导致胞外基质蛋白分泌。其中Sox9具有最重要作用，是MSCs向软骨细胞分化的关键[6]。陈明星等[7]将人UCB-MSCs通过诱导8周后发现，有均匀分布的软骨特有的细胞外基质和Ⅱ型胶原产生，认为胶原蛋白水凝胶在体内聚集TGF-β等信号分子诱导了软骨细胞的形成。辛毅等[8]用地塞米松、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、吲哚美辛和胰岛素成功诱导MSCs分化为脂肪细胞，并且在分化的细胞内有脂滴存在，表达脂肪酸结合蛋白αP2、脂蛋白脂酶和过氧化物酶体增殖物激活受体γ2。

3.2 MSCs的转分化 MSCs除向中胚层细胞分化外，还可转分化或横向分化完成跨系谱，甚至跨胚层分化，称为MSCs具有可塑性，如向心肌样细胞、神经样细胞和胰岛样细胞转分化。陈明星等[7]用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的低糖型DMEM培养液培养3代MSCs，在最佳诱导质量浓度为10 μg/L 5-氮胞苷诱导下可分化为心肌样细胞，诱导后免疫荧光检测表达心房利尿肽、受磷蛋白、β-肌球蛋白重链等心肌特异因子mRNA。虽然，UCB-MSCS能分化为心肌样细胞，但在体外是否能成功诱导向心肌样细胞分化的关键因子仍然不清楚。MSCs多向分化潜能主要取决其所处的周围环境[9]。

4 MSCs的免疫调控

MSCs细胞表面只中等表达MHC-Ⅰ类分子，低表达或不表达MHC-Ⅱ类分子及共刺激分子。李红等[10]研究发现，MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ类分子均未引起免疫反应及发挥了相似的免疫抑制作用。MHC分子表达与MSCs免疫原性及免疫调节功能的发挥并无直接联系。MSCs免疫原性极低，MSCs在体外培养和体内输注均不能活化和增殖T细胞。有研究显示，MSCs与胸腺上皮有部分相同的表面分子，能介导MSCs与T细胞的相互作用。这可能是MSCs免疫调控作用的分子学基础。越来越多的研究表明，MSCs体外实验中能有效抑制T细胞增殖。

MSCs具有低免疫原性，多种途径可发挥免疫调节作用：（1）通过抑制淋巴细胞增殖；（2）通过抑制抗原呈递细胞分化成熟及功能发挥；（3）抑制细胞毒性的杀伤性T细胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）形成；（4）增加调节性 T细胞比例等。林传明等[11]发现，狒狒骨髓来源的MSCs静脉输注体内能有效延长狒狒异体皮肤移植存活时间。杨雪等[12]发现，小鼠自体免疫性脑脊髓膜炎（ex perimentalau toimmuneencephalomyelits，EAE）模型发生EAE之前或炎症高峰期静脉输注小鼠MSCs可减轻EAE症状，病理检查显示，输注MSCs能减轻中枢神经系统炎症细胞浸润和脱髓鞘现象。其原因可能是MSCs通过抑制树突状细胞（dentritic cells，DC）的诱导产生、延迟DC的成熟、降低T细胞增殖、减少CTL形成等多种机制发挥免疫调控作用，因此，MSCs输注可能是预防和治疗移植物抗宿主病的一种细胞治疗途径。

5 UCB-MSCs的归巢

UCB-MSCs归巢到靶组织分为3个步骤：识别该处微内皮血管，透过内皮，最后进入靶组织再生。归巢描述了干细胞迁移的特点，是一个多步骤协调过程，许多细胞外基质降解蛋白酶、细胞因子、黏附因子和化学因子均参与其中最重要的特征是炎性趋化[13]。组织损伤时局部会释放多种黏附因子、生长因子、趋化因子，这一系列的微环境改变是UCB-MSCs归巢的始动因素，内环境中多种化学因子及其受体间的相互作用，指导UCB-MSCs特异性归巢于病损组织。

6 UCB-MSCS在临床中的应用潜能

脐血拥有大量造血干细胞及丰富的MSCs，其扩增后已能满足成人移植所需的细胞数，临床上UCB-MSCs移植治疗疾病已逐渐成为一种较成熟的现代治疗技术。脐血作为干细胞移植的重要来源，随着移植治疗的病种范围不断扩大，已有多个国际医学权威杂志对此作过全面综述，如《TheNewEnglandJournalofMedicine》和《Blood》等杂志。目前，从基础性研究和临床审查评估UCB-MSCs用于治疗一些疾病。

6.1 神经系统疾病

6.1.1 脑梗死、脑出血 脑缺血性疾病也称为脑缺血，因脑组织缺乏血液供应，导致脑缺氧，进而造成神经损伤。这种情况会导致的主要并发症有视力障碍、运动障碍、语言障碍等。如相应的不进行诊治，症状可能是永久性的，并危及生命。对局部缺血性动物模型进行干细胞移植，其神经系统恢复，表明干细胞移植具有安全性和有效性[14]。一些研究已表明，将UCB-MSCs移植入大脑中动脉闭塞鼠模型的大脑皮质，可成功使其神经功能恢复。表明UCB-MSCs迁移到局部缺血区并分化为神经元、神经胶质和其他不同类型的神经细胞。这可能是因为UCB-MSCs新分化生成的血管增加了缺血区域皮质血流。Bieback等[15]研究表明，移植UCB-MSCs后小鼠动物模型神经功能得到恢复和梗死面积减少。表明UCB-MSCs具有神经保护作用，引起行为功能的改善[16]。其他研究也表明，UCB-MSCs移植到缺血性脑损伤大鼠模型使血管生成，显著降低了神经功能损伤的量和神经功能障碍。

6.1.2 脊髓损伤 脊髓损伤就是脊髓受到损害或创伤。因为损失或干扰了脊髓功能，导致运动功能障碍。Friedman等[17]近年发布了令人印象深刻的数据，与对照组比较，UCB-MSCs联合脊髓移植到脊髓损伤大鼠病变区域可促进脊髓皮质纤维再生和改进自发运动功能。结果显示，在脊髓损伤区域皮质区周围再生轴突数量增加。还可观察到从植入区迁移的UCB-MSCs。推测细胞因子和干细胞生长因子释放是脊髓皮质纤维连续进展的关键机制。

6.1.3 帕金森病 帕金森病是一种神经退行性障碍疾病，患者纹状体多巴胺能神经元逐渐丧失。卢国辉等[18]将UCB-MSCs输注到帕金森病大鼠模型纹状体部分，改善了苯丙胺诱发旋转引起的病变。在另一项研究中，武晓华等[19]在帕金森病大鼠模型中发现了同样的结果。

6.1.4 阿尔茨海默病（alzheimer′s disease，AD） AD是一种神经退行性疾病，特点是神经元和大脑皮质神经突触损伤、痴呆和组织病理学改变，如老年性斑块和神经原纤维缠结[20]。β淀粉样肽（amyloid β-protein，Aβ）在大脑中沉积是该病的根本原因。另外，氧化应激和炎性反应的影响可能为AD病理作用。AD是连续进展且至今无法治愈的疾病[21]。有一些应用功效细胞治疗AD的证据。有研究已证实，在细胞培养液中使用UCB-MSCs后AD小鼠模型可减少和改善疾病症状。与实验对照比较，共同培养UCB-MSCs和海马神经可显著减少细胞凋亡。此外还表明，与实验对照比较，在注射Aβ小鼠模型的大脑中移植UCB-MSCs可减少氧化应激和神经胶质细胞的活化。陈婷等[22]研究表明，UCB-MSCT可抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的激活。认为UCB-MSCT细胞可能具有神经保护作用。对严重AD小鼠模型给予UCBMSCT，其学习和记忆可得到改善。

6.2 其他疾病

6.2.1 心肌梗死、心肌炎 机体中潜在能修复心脏损伤的干细胞主要来自骨髓和极少量来自外周血，当心脏受到损伤时各种细胞因子、可溶性受体、黏附分子等均可动员干细胞向外周血循环中转移，提高外周血中干细胞数量，但仍不足以修复受损心肌[23]。UCB-MSCs可分泌干细胞因子、白介素6及白介素11等，可动员骨髓干细胞向外周血转移，提高外周血中干细胞数量，促进干细胞向梗死心肌归巢及进一步分化、修复，达到使心肌再生和改善心功能的目的。目前，临床前期大量动物研究为应用MSCs治疗心脏疾病带来了前景。STIM和SWISSAMI试验均显示，自体来源的MSCs经冠状动脉注入治疗急性心肌梗死患者，可明显改善患者左心室射血分数[24]。这种作用在重度心功能不全患者更加明显。也有研究通过静脉注射异体MSCs治疗急性心肌梗死患者，使其临床症状缓解，3个月内增加了左心室射血分数值，较少发生室性心律失常事件[25]。

6.2.2 1型糖尿病（type1diabetesmellitus，T1DM） T1DM或青少年糖尿病是一种破坏胰腺β细胞产生胰岛素的自身免疫性疾病。虽然，该病可发生于任何年龄组，但其主要在儿童和青少年、成年人中发病。用于控制T1DM常见的方法是注射胰岛素和自我监测血糖水平。对已诊断为胰岛素依赖型糖尿病患者进行胰岛移植是最有效的治疗方法。有研究证实了不同类型干细胞（胚胎、胰、肝、骨髓和脐带血）在胰岛素产生中的作用[26]。研究人员通过将UCB-MSCs注入糖尿病大鼠肝脏已在体外培养出胰岛样细胞。移植这些细胞后可分泌人C-肽和对生理血糖水平作出反应，释放人胰岛素。其优点为可用性、可捐赠、对供体非侵入性和抵抗UCB-MSCs的低风险性[27]。因骨髓存在有限增殖、分化和使用胚胎干细胞伦理问题，因此，移植UCB-MSCs是治疗T1DM最有效的方法。

6.2.3 系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE） SLE是一种全身性自身免疫性疾病，其可影响身体任何部位。SLE患者更常发生于女性。SLE可能是由自身免疫系统攻击的结果，由自身细胞和组织产生抗体对抗自身。SLE常引起心脏、关节、皮肤、肺、血管、肝、肾和神经系统损害。Moulton等[28]选择严重SLE患者，经传统免疫抑制剂或免疫调节治疗（糖皮质激素、环磷酰胺和霉酚酸酯）和接受UCB-MSCs移植。移植后根据系统性红斑狼疮疾病活动指数（systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI）对患者进行评价，并评估抗核抗体，抗双链DNA抗体，血清补体C3、C4和清蛋白的水平和肾功能[29]。经过大概1个月时间，在所有16例患者中SLEDAI显著下降。经3、6个月后追踪观察，SLEDAI继续下降。持续追踪观察移植UCB-MSCs患者3个月，测定24小时蛋白尿、血清肌酐和尿素氮对其肾功能进行评估。所有指标均下降，另外，血清清蛋白也恢复到正常水平。调节性T细胞（如CD4+FoxP3+Tcells）作为免疫系统反应的指示器。结果表明，经移植UCB-MSCT后调节性T细胞数目增加和Th1和Th2比例重新恢复。推测免疫机制在成功移植过程中发挥了关键作用。

6.2.4 类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA） RA是一种慢性全身性炎症性疾病，发病率为1%。好发于女性。RA影响许多组织、器官，但滑膜关节是主要的靶标[30]。常见RA的不利影响是破坏关节软骨和引起关节僵硬。在RA的发病机制中炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素 6、白介素 1β和白介素17均具有重要作用[28]。RA不能治愈，但可减轻症状。新的治疗药物，如TNF-α和B细胞耗竭疗法价格昂贵，且不常使用[31]。当前，UCB-MSCs移植作为治疗RA的一种新方法。有研究通过共同培养UCB-MSCs和RA患者滑膜组织证实，UCB-MSC可抑制成纤维滑膜细胞（fibroblast like synoviocytes，FLSS）生成。FLSS是滑膜关节的固有细胞，在关节破坏和炎症中具有至关重要的作用。UCB-MSCs还可抑制基质金属蛋白酶 9对FLSS作出免疫表达和炎性反应。此外，调节性T细胞持续增加在维护RA患者的自身免疫耐受中发挥着重要作用。对UCB-MSCs在小鼠胶原诱导性关节炎（collagen induced arthritis，CIA）模型进行评估，表明这些细胞能阻止组织损伤，减少炎性反应和重新恢复Th1和Th2细胞比例。表明UCB-MSCs能显著改善小鼠CIA。

7 小结与展望

大量临床研究证明，MSCs在再生医学和基因治疗方面是安全、可行的，具有巨大潜能，充分了解MSCs能为临床各种疾病甚至一些目前尚无法医治的疾病提供更先进、更有效的治疗方法。但目前仍有许多问题亟待解决，如MSCs的分离、培养和预处理技术优化方法，诱导剂的选择，大量扩增和传代导致MSCS发生恶变[32]，如何避免其负面效应的发生等将是以后MSCS研究重点。总之，MSCs以其特有的生物学特征及大量研究数据证实，MSCs应用于治疗临床疾病具有广阔前景。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2015.11.015

：A

：1009-5519（2015）11-1640-05

2015-03-18）

谢新林（1980-），男，湖南衡阳人，在读硕士研究生，主要从事小儿心血管疾病的研究；E-mail：xiexinlin8068@163.com。

杨云华（E-mail：yangyunhua48@163.com）。