肝缺血再灌注损伤机制及相应保护措施的研究进展

彭方毅综述，李 波审校

（泸州医学院附属医院肝胆外科，四川泸州646000）

肝缺血再灌注损伤机制及相应保护措施的研究进展

彭方毅综述，李 波审校

（泸州医学院附属医院肝胆外科，四川泸州646000）

再灌注损伤； 肝细胞； 线粒体； 保护措施

肝缺血再灌注损伤（HIRI）的具体机制仍处在研究阶段，包括钙超载线粒体通透转换孔道、氧化应激、缺血再灌注损伤相关炎症因子、核转录因子、热休克蛋白、一氧化氮等。缺血再灌注损伤（IRI）是目前临床上常见的问题，进一步了解IRI机制，以及运用合适的方法去预防、治疗IRI仍然是研究热点。本文结合近年来国内外相关文献，就缺血再灌注损伤的机制及与其相关的保护措施的研究进展做一综述。

1 线粒体损伤及相应保护措施

肝细胞发生IRI时，线粒体膜通透转换孔道（mPTP）在细胞凋亡的过程中起着关键作用。Bcl-2家族蛋白等许多因子作用于线粒体，使线粒体膜上的通透性改变孔开放，继而造成线粒体跨膜电位降低甚至崩解并释放细胞色素C和凋亡诱导因子等促凋亡因子，激活caspase级联反应，导致细胞凋亡。目前研究发现氧化应激产物氧自由基（ROS）、低氧状态、能量抑制状态及高浓度的Ca2+等多种因素均可以诱导mPTP开放，然而细胞内pH降低及环孢素A（CsA）可以抑制mPTP开放[1-2]。

显然细胞损伤程度与mPTP开放的程度呈正相关，能够通过某种方式抑制mPTP开放就可能减轻IRI。研究发现mPTP受亲环素蛋白D（CypD）调控，能够特异结合CsA，并且发现CsA能够有效抑制mPTP开放，对线粒体起到一定的保护作用，IRI的动物模型中起到了保护作用[3]。国内对CsA深入研究发现，CsA的治疗作用与其剂量相关，高浓度的CsA反而会抑制线粒体功能，认为5 mg/kg是最适宜的剂量[4]。

2 氧化应激及相应保护措施

在生理情况下，体内有少部分的氧参与到氧化反应，产生少量的ROS，但此时人体内存在大量抗氧化物质，然而当肝细胞发生缺血再灌注（I/R）时，ROS生成过多以致机体平衡打破。ROS主要来源有：黄嘌呤氧化酶途径，库普弗细胞（KCs），中性粒细胞，吞噬细胞，单核细胞，以及有氧呼吸链功能障碍等。过量的ROS可造成脂质过氧化，DNA氧化及酶变性[5]。除此之外过量的ROS可以使大量的白细胞、免疫细胞、血小板聚集到肝脏的循环中，致使肝脏发生微循环障碍。

抗氧化物、抗氧化能力、抗氧化的信号通路等都是目前研究的方向。Schauer等[6]发现给予谷胱甘肽（GSH）超过100μmol/（h·kg）时候，对于肝缺血在灌注损伤有相当的保护作用。N-乙酰半胱氨酸与亲电子的氧化基团直接发生作用的自由巯基（亲核的巯基）而发挥直接抗氧化作用[7]。Masuda等[8]通过dh404诱导核转录因子（Nrf2）对动物进行缺血预处理，证实该通路可以减轻HIRI。Nrf2可以诱导抗氧化蛋白生成，在细胞抗氧化应激的过程中发挥重要作用，Nrf2诱导物可能成为有潜力的药物[9]。Yu等[10]研究中发现通过高压氧疗可以增加细胞的抗氧化能力。

3 钙超载及相应保护措施

在IRI的病理过程中，由于细胞在缺血缺氧过程中，细胞的生理平衡被打破，细胞能量供给不足，ATP急剧减少，导致能量因依赖的Na+-K+-ATP酶活性降低，细胞内Na+增多，细胞通过Na+-Ca2+离子交换弥补离子交换不足，以维持膜电位，导致细胞内Ca2+大量增多；此外Ca2+-ATP/Ca2+-Mg2+-ATP酶功能障碍，细胞不能将多余的Ca2+转运到细胞外，进一步导致了细胞内Ca2+的增多。钙超载可以从多个方面损伤细胞：促使ROS增多、激活炎症细胞释放炎症因子、促进细胞凋亡、破坏细胞膜、干扰线粒体功能等[11]。

Nauta等[12]在动物建立缺血再灌注模型前给予维拉帕米预处理，肝细胞内Ca2+的聚集受到明显抑制。线粒体ATD敏感钾通道（mitoKATP）和mPTP的差异影响了线粒体内Ca2+的平衡，诱导mitoKATP开放使线粒体膜部分去极化和抑制mPTP都可以减少Ca2+内流，从而减轻钙超载[13]。Lv等[14]使用Na+-Ca2+交换抑制剂KB-R7943，发现该抑制剂可以有效地抑制细胞凋亡，并且可以激活K+-ATP通道，促进K+和Ca2+交换，抑制钙超载。

4 炎症细胞激活及相应保护措施

HIRI可激活KCs。激活的KCs主要通过以下途径发挥作用：激活的KCs释放肿瘤坏死因子（TNF-α）及炎症因子（IL-1、IL-6、IL-12、IL-23）。TNF-α和IL-1增强了细胞内黏附因-1（ICAM-1）和血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）的表达，促进多形核白细胞（PMN）的趋化、黏附和迁移，导致中性粒细胞聚集于肝内及血管内皮细胞 （EC）损伤，从而引起微循环障碍，损伤肝组织。不仅如此，激活的KCs以及被趋化、激活的PMN还可以释放ROS损伤肝组织[15]。PMN通过NADPH途径产生活性氧代谢产物，导致肝细胞损伤甚至凋亡；PMN可以释放弹性蛋白酶、组织蛋白酶等损伤肝组织；在PMN表达的选择素和整合素，以及EC所表达的ICAM-1、VCAM-1的影响下，PMN和EC之间黏附增强，导致的PMN大量聚集到肝内，可使血液黏度增加，阻塞微血管，造成血流阻力增加[16]。

Argenbright等[17]发现白细胞和内皮细胞之间的黏附一定程度上可以被白细胞质膜上所表达的CD11/ CD18糖蛋白和内皮细胞所表达的ICAM-1调节的，使用相应的单克隆抗体可以一定程度上减少细胞间黏附，改善炎性反应和微循环。Tolba等[18]通过使用选择性COX-2抑制剂和KCs的抑制物GdCl3在IR前24 h给药预处理，发现二者均可以减少TNF-α，保护肝细胞。Kitagawa等[19]对BCAA是否对IRI有保护作用进行了探索性的研究，发现BCAA可以减轻I/R对肝功能的损伤，减少黏附分子和ET-1的表达，还可以降低门静脉压力，减轻PMN黏附，改善肝脏微循环；同时还单独分离和培养了KCs用不同剂量的BCAA进行干预，结果显示IL-1β、IL-6和ET-1均减少，而且与BCAA剂量跟反比。结果支持在围术期使用BCAA用于治疗I/R损伤。

5 炎症介质的作用及相应保护措施

细胞因子在HIRI过程中，发挥着促炎和抗炎的双重作用。炎症因子主要由KCs、PMN、内皮细胞及淋巴细胞等产生，包括TNF-α、IL-1、IFN-γ、IL-6、IL-10、HGF、VEGF等。TNF-α可以激活和趋化PMN，可以激活NF-кB、丝裂原活化蛋白激酶，造成细胞凋亡，还可以诱导ROS产物，加重IRI；IL-1作为最主要的促炎症因子，也可以激活NF-кB和巨噬细胞炎症蛋白（MIP-2），进一步诱导KCs产生TNF-α等加速炎性反应，并且招募PMN产生更多的ROS和蛋白酶，损伤肝组织；IFN-γ主要是T细胞和NKT细胞产生，其可以诱导诱发型NO合成酶（iNOS）产生，还可以调节PMN的招募和激活，参与到I/R过程，其具体作用与其剂量相关；IL-6一般被认为是促炎因子，其与gp130相结合，可以通过STAT3通路发挥抗炎作用，可以下调IL-1和TNF-α的合成，同时还能抑制IFN-γ、GM-CSF及MIP-2，还可以增加GSH的产生，对抗氧化应激所产生的损伤；IL-10作为目前研究较多的抗炎因子，被认为是最重要的抗炎因子，可以抑制炎症细胞产生细胞因子（如IFN-γ、IL-2），还具有抑制KCs促炎因子的表达、NF-кB的激活以及抑制IL-1、IL6、IL-12、MIP-2等的作用，IL-10是I/R损伤潜在的治疗点；VEGF通过络氨酸激酶途径发挥作用，通过上调TNF-α、IFN-γ及MIP-1等促进炎症细胞的聚集，导致I/R损伤；HGF可以促进肝细胞的增殖，下调ICAM-1并抑制PMN聚集发挥保护作用[15，20]。目前对于细胞因子相关治疗的研究不少，比如白介素-1受体拮抗剂（IL-1ra）、TNF-α抑制剂等。

6 核转录因子的作用及相应护措施

NF-кB是二聚体，一般是p50和p65。正常KCs中，NF-кB处在未激活状态下，与其抑制蛋白I-кB形成的复合物。HIRI时，NF-кB通过多种途径被激活：NF-кB激活的经典途径，I-кB被其激酶复合物磷酸化，随后降解；不依耐IKK复合物（I-кB激酶）途径，I-кBa酪氨酸残基磷酸化，NF-кB被激活。被激活的NF-кB转移到细胞核并激活靶基因转录，从而参与HIRI。NF-кB通过调控NOS，细胞因子（TNF-α、IL-1），趋化因子（ENA78），ICAM-1等发挥效应。Matsui等[21]在动物实验中发现，NF-кB的激活与I/R是相关的，并且使用NF-кB抑制物干预缺血再灌注可以有效减轻IRI。Xu等[22]研究发现寡聚脱氧核苷酸（ODNs）通过抑制NF-кB的激活和炎症介质的表达从而达到保护大鼠原位肝移植术后IRI。

7 一氧化氮作用及相应保护措施

NO由血管内皮细胞合成，其反应过程由NO合酶（NOS）催化。NOS包括3种形式：神经型NO合成酶（nNOS）、iNOS及内皮型NO合成酶（eNOS），其在肝内存在形式是后2型。NO在HIRI时作用有：阻止体内抗氧化剂的减少，减轻氧化应激损伤；对抗内皮素（ET）的有害作用；改善微循环。Peralta等[23]在IRI动物实验中发现NO对于肝功能的改善相当明显同时改善肝血流灌注，还发现腺苷可以刺激NO产生发挥IRI保护作用。Lang等[24]在1个小样本的前瞻性实验中发现使用NO吸入剂可以有效地保护肝移植后肝细胞，加速移植后肝功能的恢复，缩短患者住院时间。

8 热休克蛋白的作用及相应保护措施

血红素氧化酶（HO）是血红素分解代谢过程中的限速酶，分为3种类型：诱导型（HO-1）、组成型（HO-2）及发现不久的HO-3。目前研究较多的是HO-1，也称热休克蛋白32（HSP32），可以通过激活Nrf2达到抗氧化作用，其分解的产物胆绿素也具有抗氧化作用。有研究表明HO-1含量增加，可以使增加细胞外SOD和H2O2酶含量，使用HO-1拮抗剂可以使SOD和H2O2含量下降；HO-1还可以抗细胞凋亡，主要通过抗凋亡通路bcl-2和可溶性鸟苷酸环化酶来达到细胞保护的作用；HO-1分解血红素所产生的CO能保护EC，舒张血管平滑肌及抗血小板聚集改善微循环；另外HSP70也可以通过激活Nrf2通路参与HIRI保护[25-26]。

9 展 望

总结目前研究所知，可以从多个时间点对IRI进行干预：缺血预处理，缺血中处理，缺血后处理；也可以从多个方面对IRI进行干预：抗氧化应激、抗炎症因子、抑制细胞因子、改善微循环、改善能量代谢、调节信号通路等；研究过程中还有多种方法：常见药物、单克隆抗体、信号通路抑制剂、细胞因子拮抗剂、基因敲除、RNA干扰等。这些思路和方法大多数还在科学研究阶段，但是已初见成效，在不断研究HIRI机制的同时进一步提出更多、更好的保护方法，保证其能有效的、安全的用于临床是未来将要完成的工作。

[1]Costantini P，Belzacq AS，Vieira HL.Oxidation of a critical thiol residue of the adenine nucleotide translocator enforces Bcl-2-independent permeability transition pore opening and apoptosis[J].Oncogene，2000，19（2）：307-314.

[2]Kim B，Takeuchi A，Koga O，et al.Mitochondria Na（+）-Ca（2+）exchange in cardiomyocytes and lymphocytes[J].Adv Exp Med Biol，2013，961：193-201.

[3]Halestrap AP，Richardson AP.The mitochondrial permeability transition：A current perspective on its identity and role in ischaemia/reperfusion injury[J].J Mol Cell Cardiol，2015，78：129-141.

[4]雷艳.抑制线粒体MPTP开放对大鼠重要器官缺血缺氧损伤的保护作用及其机制研究[D].重庆：第三军医大学，2013.

[5]Jaeschke H.Role of reactive oxygen species in hepatic ischemia-reperfusion injury and preconditioning[J].J Invest Surg，2003，16（3）：127-140.

[6]Schauer RJ，Gerbes AL，Vonier D，et al.Glutathione protects the rat liver against reperfusion injury after prolonged warm ischemia[J].Ann Surg，2004，239（2）：220-231.

[7]Baumann J，Ghosh S，Szakmany J，et al.Short-term effects of N-acetylysteine and ischemic preconditioning in a canine model of hepatic ischemiareperfusion injury[J].Eur Surg Res，2008，41（2）：226-230.

[8]Masuda Y，Vaziri ND，Takasu C，et al.Salutary effect of pre-treatment with an Nrf2 inducer on ischemia reperfusion injury in the rat liver[J]. Gastroenterol Hepatol（Que），2014，1（1）：1-7.

[9]Ansari N，Khodagholi F，Amini M.2-Ethoxy-4，5-diphenyl-1，3-oxazine-6-one activates the Nrf2/HO-1 axis and protects against oxidative stressinduced neuronal death[J].Eur J Pharmacol，2011，658（2/3）：84-90.

[10]Yu SY，Yoon BR，Lee YJ，et al.Inhibitory effect of high temperature-and high pressure-treated red ginseng on exercise-induced oxidative stress in ICR mouse[J].Nutrients，2014，6（3）：1003-1015.

[11]岳媛媛，冯志杰.肝脏缺血再灌注损伤与钙超载[J].世界华人消化杂志，2008，16（32）：3654-3658.

[12]Nauta RI，Tsimoyiannis E，Uribe M，et al.The role of calcium ions and calcium channel entry blockers in experimental ischemia-reperfusion-induced liver injury[J].Ann Surg，1991，213（2）：137-42.

[13]Roseborough G，Gao DQ，Chon L et al.The mitochondrial K-ATP channel opener，diazoxide，prevents ischemia-reperfusion injury in the rabbit spinal cord[J].Am J Pathol，2006，168（5）：1443-1451.

[14]Lv Y，Ren Y，Sun L，et al.Protective effect of Na（+）/Ca（2+）exchange blocker KB-R7943 on myocardial ischemia-reperfusion injury in hypercholesterolemic rats[J].Cell Biochem Biophys，2013，66（2）：357-363.

[15]Guan LY，Fu PY，Li PD，et al.Mechanisms of hepatic ischemiareperfusion injury and protective effects of nitric oxide[J].World J Gastrointest Surg，2014，6（7）：122-128.

[16]Teoh NC，Farrell GC.Hepatic ischemia reperfusion injury：pathogenic mechanisms and basis for hepatoprotection[J].J Gastroenterol Hepatol，2003，8（8）：891-902.

[17]Argenbright LW，Letts LG，Rothlein R.Monoclonal antibodies to the leukocyte membrane CD18 glycoprotein complex and to intercellular adhesion molecule-1 inhibit leukocyte-endothelial adhesion in rabbits[J].J Leukoc Biol，1991，49（3）：253-257.

[18]Tolba RH，Fet N，Yonezawa K，et al.Role of preferential cyclooxygenase-2 inhibition by meloxicam in ischemia/reperfusion injury of the rat liver[J]. Eur Surg Res，2014，53（1/4）：11-24.

[19]Kitagawa T，Yokoyama Y，Kokuryo T，et al.Protective effects of branchedchain amino acids on hepatic ischemia-reperfusion-induced liver injury in rats：a direct attenuation of Kupffer cell activation[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2013，304（4）：G346-355.

[20]Tukhovskaya EA，Turovsky EA，Turovskaya MV，et al.Anti-inflammatory cytokine interleukin-10 increases resistance to brain ischemia through modulation of ischemia-induced intracellular Ca2+response[J].Neurosci Lett，2014，571：55-60.

[21]Matsui N，Kasajima K，Hada M，et al.Inhibiton of NF-kappaB activation during ischemia reduces hepatic ischemia/reperfusion injury in rats[J].J Toxicol Sci，2005，30（2）：103-110.

[22]Xu MQ，Shuai XR，Yan ML，et al.Nuclear factor-kappa B decoy oligodeoxynucleotides attenuates ischemia/reperfusion injury in rat liver graft[J]. World J Gastroenterol，2005，28，11（44）：6960-6967.

[23]Peralta C，Hotter G，Closa D，et al.Protective effect of preconditioning on the injury associated to hepatic ischemia-reperfusion in the rat：role of nitric oxide and adenosine[J].Hepatology，1997，25（4）：934-937.

[24]Lang JD，Teng X，Chumley P，et al.Inhaled NO accelerates restoration of liver function in adults following orthotopic liver transplantation[J].J Clin Invest，2007，117：2583-2591.

[25]Jaeschke H，Woolbright BL.Current strategies to minimize hepatic ischemia-reperfusion injury by targeting reactive oxygen species[J].Transplant Rev（Orlando），2012，26（2）：103-114.

[26]Origassa CS，Câmara NO.Cytoprotective role of heme oxygenase-1 and heme degradation derived end products in liver injury[J].World J Hepatol，2013，5（10）：541-549.

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.12.023

:A

:1009-5519（2015）12-1821-03

2015-03-14）

彭方毅（1987-），男，四川泸州人，在读硕士研究生，主要从事肝胆外科临床和科研工作；E-mail：494653428@qq.com。

李波（E-mail：liboer2002@126.com）。