低氧性肺动脉高压患者肺小动脉壁Siah1表达情况及其临床意义

符代炎，戴爱国，胡瑞成，田 华，陈云荣，朱黎明

·论著·

低氧性肺动脉高压患者肺小动脉壁Siah1表达情况及其临床意义

符代炎，戴爱国，胡瑞成，田 华，陈云荣，朱黎明

目的 探讨低氧性肺动脉高压(HPH)患者肺小动脉壁Siah1表达情况及其临床意义。方法 收集湖南省肿瘤医院胸外科2008-04-01至2009-03-31行肺叶切除术的肺鳞癌患者36例，将除肺鳞癌外无其他肺部疾病患者12例纳入对照组，COPD非肺动脉高压患者12例纳入COPD组，COPD并HPH患者12例纳入PH组。收集患者肺组织，观察其肺血管重塑指标〔肺小动脉管壁厚度/血管外径(WT%)、肺小动脉管壁面积/管总面积(WA%)、肺小动脉管腔面积/管总面积(LA%)〕，采用原位杂交法与免疫组织化学法检测肺小动脉壁Siah1 mRNA及其蛋白表达情况。结果 光镜下可见对照组患者肺小动脉管壁薄，管腔大；COPD组患者肺小动脉管壁出现增厚，管腔狭窄；PH组患者肺小动脉管壁厚度进一步增加，管腔明显变窄。COPD组患者WA%、WT%高于对照组，LA%低于对照组(P<0.05)；PH组患者WA%、WT%高于COPD组，LA%低于COPD组(P<0.05)。原位杂交结果显示，对照组患者肺小动脉壁Siah1 mRNA呈低表达，COPD组、PH组患者肺小动脉壁Siah1 mRNA表达逐渐增高。免疫组织化学结果显示，对照组患者肺小动脉壁Siah1蛋白呈低表达，COPD组、PH组患者肺小动脉壁Siah1蛋白表达逐渐增高。PH组患者肺小动脉壁Siah1 mRNA相对表达量及其蛋白水平高于COPD组，COPD组高于对照组(P<0.05)。直线相关分析结果显示，Siah1蛋白水平与Siah1 mRNA相对表达量呈正相关(r=0.873，P<0.01)；Siah1 mRNA相对表达量与WA%、WT%、肺动脉收缩压(PASP)均呈正相关(r值分别为0.797、0.845、0.728，P<0.01)，Siah1蛋白水平亦与WA%、WT%、PASP呈正相关(r值分别为0.791、0.791、0.704，P<0.01)。结论 HPH患者肺小动脉壁Siah1呈高表达，且肺小动脉壁Siah1表达与低氧性肺血管重塑及PASP有关，可能机制为慢性肺泡性低氧上调患者肺小动脉壁Siah1表达，进而参与HPH的发病。

高血压，肺性；缺氧；Siah1

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)的常见病因，其中慢性低氧导致的低氧性肺血管重塑(hypoxic pulmonary vascular remodeling， HPSR)是HPH的主要发病环节[1]。Siah是果蝇sina(seven in absentia)基因产物的类似物，分为Siah1和Siah2两个亚型[2]，其中拥有E3泛素连接酶活性的Siah1蛋白参与HPH大鼠HPSR的形成[3]，但在HPH患者肺动脉高压形成过程中，Siah1的表达情况尚不清楚。本研究通过研究HPH患者肺小动脉壁Siah1表达情况，探讨Siah1在HPH发病中的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料 链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(streptavidin-biotin complex，SABC)免疫组织化学染色试剂盒、二甲氨基偶氮苯(dimethylaminoazobenzene，DAB)显色试剂盒、地高辛标记多相寡核苷酸杂交探针(均为武汉博士德生物工程有限公司生产)，其中人Siah1 mRNA序列参照文献[3]。Siah1抗体(美国Santa Cruz公司)，HP4500型彩色多普勒超声诊断仪(美国惠普公司)，福田ST-150型肺功能仪(日本福田产业株式会社)，PIPS-2020型病理图像分析系统(重庆天海医疗设备有限公司)。

1.2 诊断标准及排除标准 诊断标准：(1)采用多普勒超声心动图测量右心房瓣最大反流速度(V)，按照改良柏努力公式计算右心房、室压差约等于4V2，再加上标准右心房压10 mm Hg(1 mm Hg =0.133 kPa)即为估测的肺动脉收缩压(pulmonary artery systolic pressure，PASP)[4]；(2)肺鳞癌的临床分期依据美国联合癌症分类委员会和国际抗癌联盟2002年制定的TNM分期标准；(3)COPD的诊断标准依据“慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2007年修订版)”[5]；(4)多普勒超声心动图在肺动脉高压诊断或筛查中的价值与右心导管测量肺动脉压的可靠性高度相关[6]，静息状态下经胸多普勒超声心动图估测PASP≥40 mm Hg诊断为肺动脉高压[4]。排除标准[7-9]：(1)肺鳞癌和/或COPD以外的肺部疾病；(2)肺鳞癌压迫肺血管；(3)睡眠呼吸障碍；(4)左心疾病；(5)严重肝脏、肾脏、内分泌疾病；(6)结缔组织疾病；(7)先天性体-肺分流性心脏病；(8)HIV感染；(9)脾切除术后；(10)使用减肥药。

1.3 临床肺标本 收集湖南省肿瘤医院胸外科2008-04-01至2009-03-31行肺叶切除术的肺鳞癌患者36例，均经病理确诊，术前未行放化疗及生物反应调节剂治疗，术前完善三大常规、凝血全套、肝肾功能、血脂及血糖、甲状腺功能七项、输血前五项、自身抗体谱、细胞免疫及体液免疫、血气分析检查等，并行心功能、肺功能、胸部影像学、多普勒超声心动图等检查。将除肺鳞癌外无其他肺部疾病的12例患者纳入对照组，COPD非肺动脉高压12例患者纳入COPD组；COPD并HPH 12例患者纳入PH组。本研究获得湖南省肿瘤医院伦理委员会批准。

1.4 肺小动脉形态学分析 选取远离肺鳞癌5 cm以上、无癌浸润的外周肺组织作为标本[10]，采用10%中性甲醛固定12 h，脱水后石蜡包埋，切片，厚度4 μm，HE染色，每个患者随机选取3张切片，每张切片随机选取5支直径200 μm左右的肺小动脉，测定肺小动脉管壁厚度/血管外径(WT%)、肺小动脉管壁面积/管总面积(WA%)、肺小动脉管腔面积/管总面积(LA%)作为肺小动脉重塑评价指标[11]。

1.5 肺小动脉壁Siah1原位杂交及结果分析 参照说明书及文献[12]的杂交步骤，DAB显色棕黄色为阳性。每例患者选3张结构完整的切片，每张切片以随机选5支直径100 μm左右的肺小动脉，检测肺小动脉管壁平均吸光度(A)值作为管壁Siah1 mRNA相对表达量。

1.6 肺小动脉壁Siah1免疫组织化学检测及结果分析 参照SABC免疫组织化学染色试剂盒说明书及文献[12]的方法，其中一抗为1∶100稀释，DAB显色棕黄色为阳性。肺小动脉选择及管壁Siah1蛋白相对表达量检测同原位杂交。

2 结果

2.1 3组患者临床资料比较 3组患者年龄、肺鳞癌分化程度、肺鳞癌临床分期、肺标本取材部位及年龄比较，差异无统计学意义(P<0.05)；3组患者第一秒用力呼气容积占预计值百分比(FEV1%)、第一秒用力呼气容积占用力肺活量百分比(FEV1/FVC)、动脉血氧分压(PaO2)及PASP比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。COPD组患者FEV1%、FEV1/FVC及PaO2低于PH组和对照组，PH组患者上述指标低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；PH组患者PASP高于对照组和COPD组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1、2)。

表1 3组患者临床资料比较(例)

2.2 3组患者肺小动脉形态学改变 光镜下可见对照组患者肺小动脉管壁薄，管腔大；COPD组患者肺小动脉管壁出现增厚，管腔狭窄；PH组患者肺小动脉管壁厚度进一步增加，管腔明显变窄(见图1)。3组患者WA%、WT%及LA%比较，差异有统计学意义(P<0.05)；COPD组患者WA%、WT%高于对照组，LA%低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；PH组患者WA%、WT%高于COPD组，LA%低于COPD组，差异有统计学意义(P<0.05，见表3)。

表2 3组患者临床资料比较

注：FEV1%=第一秒用力呼气容积占预计值百分比，FEV1/FVC=第一秒用力呼气容积占用力肺活量百分比，PaO2=动脉血氧分压，PASP=肺动脉收缩压；与对照组比较，△P<0.05；与COPD组比较，▲P<0.05

表3 3组患者WA%、WT%及LA%比较

注：WA%=肺小动脉管壁面积/管总面积，WT%=肺小动脉管壁厚度/血管外径，LA%=肺小动脉管腔面积/管总面积；与对照组比较，△P<0.05；与COPD组比较，▲P<0.05

2.3 3组患者肺小动脉壁Siah1 mRNA表达及其蛋白水平比较 原位杂交结果显示，对照组患者肺小动脉壁Siah1 mRNA呈低表达，COPD组、PH组患者肺小动脉壁Siah1 mRNA表达逐渐增高，见图2。免疫组织化学结果显示，对照组患者肺小动脉壁Siah1蛋白呈低表达，COPD组、PH组患者肺小动脉壁Siah1蛋白表达逐渐增高，见图3。3组患者肺小动脉壁Siah1 mRNA相对表达量及其蛋白水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中PH组患者肺小动脉壁Siah1 mRNA相对表达量及其蛋白水平高于COPD组，COPD组高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见表4)。

图1注：A为对照组，B为COPD组，C为PH组

Table 4 Comparison of mRNA relative expression and protein level of Siah1 in pulmonary arteriole walls among the three groups

组别例数Siah1mRNA相对表达量Siah1蛋白对照组120 033±0 0050 035±0 005COPD组120 077±0 009△0 068±0 008△PH组120 089±0 010△▲0 078±0 010△▲F值150 815126 604P值<0 01<0 01

注：与对照组比较，△P<0.05；与COPD组比较，▲P<0.05

2.4 相关性分析 直线相关分析结果显示，PaO2与WA%、WT%、PASP均呈负相关(r值分别为-0.694、-0.781、-0.833，P<0.01)。WA%、WT%与PASP均呈正相关(r值分别为0.814、0.857，P<0.01)。Siah1蛋白水平与Siah1 mRNA相对表达量呈正相关(r=0.873，P<0.01)。Siah1 mRNA相对表达量与WA%、WT%、PASP均呈正相关(r值分别为0.797、0.845、0.728，P<0.01)，Siah1蛋白水平亦与WA%、WT%、PASP呈正相关(r值分别为0.791、0.791、0.704，P<0.01)。

3 讨论

慢性肺泡性低氧诱导肺血管重塑是COPD引起HPH的主要原因[12]。本研究结果显示，COPD组患者PaO2低于对照组，肺小动脉管壁出现增厚，肺小动脉管腔变窄，图像分析结果显示WA%与WT%增加、LA%降低，提示COPD组患者发生HPSR；PH组患者PaO2进一步降低，HPSR更明显。相关性分析显示，PaO2与WA%、WT%、PASP均呈负相关，WA%、WT%与PASP均呈正相关，证实慢性肺泡性低氧诱导HPSR，导致肺血管阻力增加，进而引起HPH。

Siah1在哺乳动物中高度保守，低氧可诱导其表达[13]。本课题组进行的前期研究提示，慢性低氧可诱导大鼠肺小动脉壁Siah1表达增加，进而参与大鼠HPH的发病[3]。本研究结果显示，对照组患者肺小动脉壁Siah1 mRNA及其蛋白呈低表达，COPD组、PH组患者肺小动脉壁Siah1 mRNA及其蛋白表达逐渐增高，且两者在时间上相一致。相关性分析显示，肺小动脉壁Siah1蛋白水平与Siah1 mRNA相对表达量呈正相关，提示慢性肺泡性低氧同样可上调肺小动脉壁Siah1的表达。本课题组进行的前期研究结果显示，脯氨酰羟化酶1、脯氨酰羟化酶3及低氧诱导因子抑制因子蛋白水平降低在大鼠HPH发病中具有重要作用[14-15]；有研究结果显示，Siah1可介导脯氨酰羟化酶1、脯氨酰羟化酶3及低氧诱导因子抑制因子经泛素蛋白本酶体途径降解[13，16]。本研究结果显示，肺小动脉壁Siah1 mRNA相对表达量及其蛋白水平均与WA%、WT%、PASP呈正相关，提示Siah1可能参与HPH的发病，究其原因，可能与慢性肺泡低氧上调患者肺小动脉壁Siah1表达，进而降低脯氨酰羟化酶1、脯氨酰羟化酶3及低氧诱导因子抑制因子的蛋白水平有关，但具体机制有待进一步研究。

综上所述，HPH患者肺小动脉壁Siah1呈高表达，且肺小动脉壁Siah1表达与HPSR及PASP有关，可能机制为慢性肺泡性低氧上调患者肺小动脉壁Siah1表达，进而参与HPH的发病。

【编后语】

作者所在课题组通过一系列基础及临床研究探讨了低氧性肺动脉高压对Siah1表达的影响，认为Siah1参与了低氧性肺动脉高压的发病，但单就本研究来讲，选取的研究对象均为肺鳞癌患者，未设置正常对照，且样本量较小，期待能在以后的研究中加以完善，以更好地指导临床。

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(本文编辑：谢武英)

Expression of Siah1 of Pulmonary Arteriole Walls and Its Significance in Patients with Hypoxic Pulmonary Hypertension

FUDai-yan，DAIAi-guo，HURui-cheng，etal.Hu′nanProvincialGeriatricHospital；DepartmentofRespiratoryMedicine，Hu′nanGerontologyInstitute；DepartmentofRespiratoryMedicine，MawangduiSanatoriumofHu′nanProvince，Changsha410016，China

Objective To investigate the expression of Siah1 of pulmonary arteriole walls and its significance in patients with hypoxic pulmonary hypertension.Methods From 2008-04-01 to 2009-03-31，a total of 36 lung squamous carcinoma patients undergoing pulmonary lobectomy were selected in the Department of Thoracic Surgery，Hu′nan Provincial Tumor Hospital，thereinto 12 patients without other pulmonary disease were served as A group，12 patients with COPD were served as B group，12 patients with COPD and hypoxic pulmonary hypertension were served as C group.Pulmonary vascular remodeling index including WT%，WA%，LA% was compared among the three groups；insitu hybridization method was used to detect the Siah1 mRNA expression，and immunohistochemical method was used to detect the Siah1 protein expression.Results Light microscope found that，the pulmonary arteriole walls of A group was thin，and the lumen was big；the pulmonary arteriole walls of B group was thickening，and the lumen was narrow；the pulmonary arteriole walls of C group was more thickening than that of B group，and the lumen was obviously narrow.WA% and WT% of B group were statistically significantly higher than those of A group，while LA% of B group was statistically significantly lower than that of A group(P<0.05)；WA% and WT% of C group were statistically significantly higher than those of B group，while LA% of C group was statistically significantly lower than that of B group(P<0.05).By insitu hybridization method and immunohistochemical method，Siah1 mRNA expression and protein expression of A group were low，and those of groups B and C were increasingly higher.mRNA relative expression and protein level of Siah1 of C group were statistically significantly higher than those of B group，and those of B group were statistically significantly higher than those of A group(P<0.05).Linear correlation analysis showed that，mRNA relative expression of Siah1 was positively correlated with protein level of Siah1(r=0.873，P<0.01)；mRNA relative expression of Siah1 was positively correlated with WA%，WT%，PASP，respectively(r=0.797，0.845，0.728，P<0.01)；protein level of Siah1 was positively correlated with WA%，WT%，PASP，respectively(r=0.791，0.791，0.704，P<0.01).Conclusion The expression of Siah1 of pulmonary arteriole walls is high in patients with hypoxic pulmonary hypertension，and it is correlated with hypoxic pulmonary vascular remodeling and PASP；chronic alveolar hypoxia may induce the expression of Siah1 of pulmonary arteriole walls，and lead to hypoxic pulmonary hypertension at last.

Hypertension，pulmonary；Anoxia；Siah1

国家自然科学基金资助项目(30971329，81270118)；湖南省自然科学基金资助项目(12JJ3111)；湖南省中医药科研计划项目(2013138)

410016湖南省长沙市，湖南省老年医院 湖南省老年医学研究所呼吸疾病研究室 湖南省马王堆疗养院呼吸内科

戴爱国，410016湖南省长沙市，湖南省老年医院 湖南省老年医学研究所呼吸疾病研究室 湖南省马王堆疗养院呼吸内科；E-mail：daiaiguo2003@163.com

R 544

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2015.05.009

2015-02-13；

2015-05-09)

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