喉鳞状细胞癌患者癌组织中AHNAK基因转录表达情况及其临床意义研究

张军华

·论著·

喉鳞状细胞癌患者癌组织中AHNAK基因转录表达情况及其临床意义研究

张军华

目的 研究喉鳞状细胞癌(LSCC)患者癌组织中AHNAK基因转录表达情况及其临床意义。方法 采集荆州市肿瘤医院耳鼻喉科手术切除的LSCC癌组织标本62例，27例癌旁正常组织标本也取自62例LSCC患者。提取组织RNA，反转录为cDNA，采用实时荧光定量PCR法分析癌组织与癌旁正常组织中AHNAK基因mRNA表达情况。结果 癌组织中AHNAK基因mRNA相对表达量为(3.23±1.53)，高于癌旁正常组织的(1.35±0.59)(P<0.05)。不同性别、分型及组织病理分级的LSCC患者癌组织中AHNAK基因mRNA相对表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。年龄≥65岁及41～64岁患者癌组织中AHNAK基因mRNA相对表达量高于≤40岁患者，临床分期Ⅲ/Ⅳ期患者癌组织中AHNAK基因mRNA相对表达量高于Ⅰ/Ⅱ期患者，淋巴结转移阳性患者癌组织中AHNAK基因mRNA相对表达量高于淋巴结转移阴性患者(P<0.05)。结论 LSCC患者癌组织中AHNAK基因转录表达与年龄、临床分期、淋巴结转移有关，AHNAK可以成为预测、评价LSCC恶性程度的一个重要标志物。

喉肿瘤；癌，鳞状细胞；AHNAK

喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell cancer，LSCC)发病率占全身恶性肿瘤的5.7%～7.6%，在耳鼻喉科领域中仅次于鼻咽癌和鼻腔鼻窦癌而位居第3位。尽管临床上对喉癌的治疗已进行了大量研究，但患者5年生存率仍未得到明显改善。而喉癌的进一步研究热点集中在能进行精确诊断、评估治疗效果和预后的临床病理学因子方面，钙调蛋白AHNAK亦称桥粒联结蛋白(desmoyokin)，广泛表达于各类型细胞，且参与多种细胞的生理过程，包括钙离子调节及肌动蛋白细胞骨架的成形[1-2]。AHNAK与肿瘤细胞伪足形成有关，会影响肿瘤细胞的迁移和侵袭。本研究采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)法检测LSCC患者癌组织及其癌旁组织中AHNAK基因mRNA表达情况，并探讨其与LSCC临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 采集荆州市肿瘤医院耳鼻喉科手术切除的LSCC癌组织标本62例，均为首治患者，经临床和病理检查确诊。其中男48 例， 女14例；年龄35～82岁，平均(58±2)岁。按2002年国际抗癌联盟(UICC)修订标准分为声门上型14例、声门型32例和声门下型16例；临床分期：Ⅰ/Ⅱ期30例，Ⅲ/Ⅳ期32例；组织病理分级：低分化鳞癌9例、中分化鳞癌28例和高分化鳞癌25例；其中淋巴结转移阳性21例。27例癌旁正常组织标本也取自62例LSCC患者，癌旁正常组织切取时距肿瘤边缘1 cm以上。标本采集后立即投入液氮中速冻并保存备用。

1.2 主要试剂与设备 反转录试剂盒(PrimerScriptTMRT reagent Kit)和RT-PCR试剂盒(SYBR Premix Ex Taq)购自日本Takara公司；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；Tris-NH4Cl缓冲液配制方案：NH4Cl 1.03 g，三羟甲基氨基甲烷 3.735 g，加双蒸水至500 ml，用HCl调整pH值至7.2；RT-PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(见表1)。PCR扩增仪(PERKIN ELMER-2231型)购自美国PE公司，RT-PCR仪StepOneTM购自美国Applied Biosystems公司。

表1 RT-PCR引物序列

1.3 实验方法

1.3.1 提取组织RNA 组织样本加入1 ml Trizol试剂后用研磨器研磨，匀浆彻底反复吹打混匀，冰上静置15 min，加入200 μl三氯甲烷，颠倒振荡15 s，冰上静置10 min，4 ℃ 12 000 r/min离心；取上层液0.4～0.5 ml于新的EP管，加入等体积异丙醇颠倒混匀，冰上静置5 min，4 ℃ 13 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入4 ℃ 75%乙醇1 ml〔二乙基焦碳酸酯(DEPC)水配制〕，颠倒混匀，4 ℃ 10 000 r/min离心5 min，弃上清液真空干燥30 min，用DEPC水30 μl使RNA完全溶解、混匀。取制备的总RNA样品3 μl，加Nuclease-Free水至1 ml，以紫外分光光度计测定RNA纯度。

1.3.2 反转录 采用Takara公司的PrimerScriptTMRT reagent Kit 反转录试剂盒进行：取0.5 μg RNA模板，反应体系10 μl。反转录反应条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。反应结束后补加30 μl双蒸水进行稀释即可作为PCR反应模板，放置于-20 ℃冰箱保存。

1.3.3 聚合酶联反应(PCR) 采用SYBR Premix Ex Taq RT-PCR试剂盒进行：扩增产物长度为162 bp。PCR反应体系为20 μl，含DNA模版2 μl，循环参数：预变性95 ℃ 30 s，变性95 ℃ 5 s，退火57 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s，循环40次。

1.3.4 mRNA相对表达量 选择GAPDH管家基因作为内参照，AHNAK基因mRNA相对表达量的计算采用2-ΔΔCt法，即：2-(ΔCtAHNAK-ΔCtGAPDH)。

2 结果

2.1 基因cDNA PCR倍增全过程 本研究所采用的RT-PCR法是实时记录电脑监控下每个样本基因cDNA PCR倍增全过程(见图1)。以每次PCR循环结束后荧光强度代表基因数量，在指数期采集各个样本数据，经内参数校正后显示癌组织及癌旁组织相对定量AHNAK基因mRNA表达水平。

图1 cDNA PCR倍增全过程

2.2 不同临床病理特征LSCC患者AHNAK基因mRNA表达情况 癌组织中AHNAK基因mRNA相对表达量为(3.23±1.53)，高于癌旁正常组织的(1.35±0.59)，差异有统计学意义(t=6.27，P<0.05)；不同性别、分型及组织病理分级的LSCC患者癌组织中AHNAK基因mRNA相对表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)；不同年龄、临床分期及淋巴结是否转移的LSCC患者癌组织中AHNAK基因mRNA相对表达量比较，差异有统计学意义(P<0.05)。其中年龄≥65岁及41～64岁患者癌组织中AHNAK基因mRNA相对表达量高于≤40岁患者，临床分期Ⅲ/Ⅳ期和淋巴结转移阳性患者癌组织中AHNAK基因mRNA相对表达量分别高于Ⅰ/Ⅱ期、淋巴结转移阴性患者，差异均有统计学意义(P<0.05，见表2)。

Table 2 Comparison of AHNAK gene mRNA relative expression in carcinoma tissue of different clinical characteristics of LSCC patients

临床病理特征例数AHNAK基因mRNA相对表达量t(F)值P值年龄(岁)6 45∗<0 05 ≤40182 22±1 47 41～64273 20±1 71 ≥65173 21±1 49性别0 66>0 05 男482 99±1 53 女143 21±1 51分型0 54∗>0 05 声门上型142 52±1 46 声门型323 82±1 49 声门下型163 48±1 44组织病理分级0 76∗>0 05 低分化93 29±1 48 中分化282 53±1 41 高分化252 49±1 38临床分期9 61<0 05 Ⅰ/Ⅱ期303 02±1 52 Ⅲ/Ⅳ期3212 52±5 21淋巴结转移7 90<0 05 阳性219 81±4 32 阴性413 78±1 67

注：*为F值

3 讨论

LSCC是一种发病率高、病情复杂、预后较差的耳鼻喉科疾病，其癌细胞转移是影响患者预后的主要因素。AHNAK是一个分子质量为700 kDa的巨大蛋白质，广泛分布于多种类型细胞[3]，其可能参与结肠上皮细胞的诱变、转型过程，因此认为AHNAK具有致癌作用[4]；也有学者发现，AHNAK基因在结直肠癌等多种人类恶性肿瘤中的表达水平较高，AHNAK的异常表达可能与肿瘤细胞的浸润、转移相关[5]。Shankar等[6]认为，AHNAK影响肿瘤细胞伪足的形成和迁移/侵袭过程，是肿瘤细胞伪足形成和迁移/侵袭过程中必不可少的因素之一。

Dumitru等[7]研究发现，AHNAK可以作为评价LSCC患者生存期的一个比较新的独立预后因子，可以为LSCC的诊断、预后和针对性治疗提供准确的信息。其研究结果表明，LSCC癌组织中AHNAK基因的过量表达缩短了LSCC患者的生存期，如果AHNAK与巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、CD66b等炎性标志物同时存在于LSCC患者癌组织中，则可更明显地缩短LSCC患者的生存期，研究还提示中性粒细胞可能通过AHNAK增强肿瘤细胞的迁移/侵袭能力。

LSCC患者癌组织中AHNAK的转录表达情况仍不清楚，本研究采用RT-PCR法证实62例LSCC患者癌组织中AHNAK基因mRNA相对表达量高于癌旁正常组织，且中年患者癌组织中AHNAK基因mRNA相对表达量高于青年患者，这可能与本研究中中年晚期患者较多有关。本研究结果还显示，临床分期Ⅲ/Ⅳ期和淋巴结转移阳性患者癌组织中AHNAK基因mRNA相对表达量分别高于Ⅰ/Ⅱ期、淋巴结转移阴性患者，提示AHNAK基因在LSCC患者癌组织中的表达与临床分期和淋巴结转移有关，但与性别无明显关系。值得注意的是，不同分型患者癌组织中AHNAK基因mRNA相对表达量间无差异，尚需大样本研究进一步分析。

综上所述，LSCC患者癌组织中AHNAK基因的表达水平与年龄、临床分期、淋巴结转移有关，AHNAK可以成为预测、评价LSCC恶性程度的一个重要标志物，可以为LSCC的诊断、治疗和预后提供准确的信息，为LSCC的临床诊疗提供新的思路。

[1]Gentil BJ，Delphin C，Mbele GO，et al.The giant protein AHNAK is a specific target for the calcium-and zinc-binding S100B protein: potential implications for Ca2+homeostasis regulation by S100B[J].J Biol Chem， 276(2001)：23253-23261.

[2]Haase H，Podzuweit T，Lutsch G，et al.Signaling from beta-adrenoceptor to L-type calcium channel: identification of a novel cardiac protein kinase A target possessing similarities to AHNAK[J].Faseb J，1999，13(15)：2161-2172.

[3]Shtivelman E，Cohen FE， Bishop JM.A human gene(AHNAK) encoding an unusually large protein with a 1.2-microns polyionic rod structure[J].Proc Natl Acad Sci USA，1992，89(12)：5472-5476.

[4]Tanaka M，Jin G，Yamazaki Y，et al.Nakamura，Identification of candidate cooperative genes of the Apc mutation in transformation of the colon epithelial cell by retroviral insertional mutagenesis[J].Cancer Sci，2008，99(5)：979-985.

[5]Nozawa H，Chiu C，Hanahan D.Infiltrating neutrophils mediate the initial angiogenic switch in a mouse model of multistage carcinogenesis[J].Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(33)：12493-12498.

[6]Shankar J， Messenberg A，Chan J，et al.Pseudopodial actin dynamics control epithelial-mesenchymal transition in metastatic cancer cells[J].Cancer Res，2010，70(9)：3780-3790.

[7]Dumitru CA，Bankfalvi A，Gu X，et al.AHNAK and inflammatory markers predict poor survival in laryngeal carcinoma[J].PLoS One，2013，8(2)：e56420.

(本文编辑：谢武英)

Transcriptional Expression of AHNAK Gene of Laryngeal Squamous Cell Cancer and Its Clinical Significances

ZHANGJun-hua.DepartmentofOtorhinolaryngology，theTumorHospitalofJingzhou，Jingzhou434000，China

Objective To investigate the transcriptional expression of AHNAK gene of laryngeal squamous cell cancer(LSCC)and its clinical significances.Methods A total of 62 LSCC samples and 27 normal samples adjacent to carcinoma were collected in the Department of Otorhinolaryngology，the Tumor Hospital of Jingzhou.RNA was extracted and reverse transcribed to cDNA，real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect the transcriptional expression of AHNAK gene.Results The relative mRNA quantity of AHNAK gene of LSCC samples was(3.23±1.53)，was higher than that of normal samples adjacent to carcinoma of(1.35±0.59)(P<0.05).No statistically significant differences of relative mRNA quantity of AHNAK gene was found in patients with different gender，UICC classifications or histopathologic grading(P>0.05)；relative mRNA quantity of AHNAK gene of patients aged over or equal to 65 years old and at 41 to 64 years old was higher than that of patients aged less than or equal to 40 years old，respectively；relative mRNA quantity of AHNAK gene of patients with clinical staging at Ⅲ to Ⅳ was higher than that of patients with clinical staging at Ⅰ to Ⅱ；relative mRNA quantity of AHNAK gene of patients with lymphatic metastasis was higher than that of patients without lymphatic metastasis(P<0.05).Conclusion Transcriptional expression of AHNAK gene of LSCC is correlated with age，clinical staging and lymphatic metastasis，may be a important tumor marker for predicting or evaluating the severity of LSCC.

Laryngeal neoplasms；Carcinoma，squamous cell；AHNAK

434000 湖北省荆州市肿瘤医院耳鼻咽喉科

张军华.喉鳞状细胞癌患者癌组织中AHNAK基因转录表达情况及其临床意义研究[J].实用心脑肺血管病杂志，2015，23(2)：46-48.[www.syxnf.net]

R 739.65

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2015.02.014

2014-09-12；

2015-01-26)

Zhang JH.Transcriptional expression of AHNAK gene of laryngeal squamous cell cancer and its clinical significances[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2015，23(2)：46-48.