红花查尔酮异构酶基因全长cDNA的克隆及表达分析

刘秀明，杨文婷，张雪萌，焦重达，姚 娜，杨美英，官丽莉，李海燕，李校堃

(吉林农业大学 a 生物反应器与药物开发教育部工程研究中心，b 生命科学学院，吉林 长春 130118)

红花查尔酮异构酶基因全长cDNA的克隆及表达分析

刘秀明a,b，杨文婷a,b，张雪萌b，焦重达b，姚 娜a，杨美英b，官丽莉a，李海燕a,b，李校堃a

(吉林农业大学 a 生物反应器与药物开发教育部工程研究中心，b 生命科学学院，吉林 长春 130118)

【目的】 克隆红花(CarthamustinctoriusL.)黄酮合成途径中的关键酶查尔酮异构酶(Chalcone isomerase，CHI)基因的全长序列，研究其组织表达特异性，为红花代谢调控研究提供参考。【方法】 利用RT-PCR技术克隆CHI基因的cDNA全长，并对其全长基因进行生物信息学分析；构建系统发育树，研究其与相似序列的同源性；利用实时荧光定量 PCR方法，分析CHI基因在红花不同开花时期的表达量。【结果】CHI基因全长1 161 bp，开放阅读框长654 bp，编码217个氨基酸，理论分子质量约为23.14 ku，等电点为5.67，序列含有典型的加尾信号序列AATAA和Poly(A)。系统发育树表明，该基因与其他物种CHI基因具有较高的同源性，其中与青木香的同源性最高，达到82%。实时荧光定量PCR结果表明，CHI基因在红花花蕾期的表达量最高。【结论】 克隆得到了红花CHI基因，其在红花花蕾期的表达量最高。

红花；查尔酮异构酶；cDNA克隆；real-time PCR

红花(CarthamustinctoriusL.)属菊科，为一年生草本植物。红花具有活血通经，去瘀疗伤，宣毒透疹等功效，其主要有效成分为红花黄色素和红花红色素[1]。红花黄色素为红花中多种水溶性查尔酮成分的混合物，是黄酮化合物中重要的一类，不但是很有价值的食用色素，而且具有活血通络、消炎镇痛等功效，在血管性疾病、高血压、糖尿病并发症等方面亦有重要疗效[2]。查尔酮异构酶(Chalcone isomerase，CHI；EC5.5.1.6)是植物黄酮化合物合成途径中的关键酶之一[3-4]，其在黄酮化合物合成中将查尔酮异构化生成槲皮素[5]。因此，超表达查尔酮异构酶基因，可以提高红花黄酮化合物的含量，为大量生产红花黄色素提供了可能。目前，国内外关于查尔酮异构酶的研究报道较多，主要集中在葫芦巴[6]、青木香属[7]、苜蓿[8]、水稻[9]、柑橘[10]、桑树[11]、金花茶[12]、水仙[13]、花生[14]等多种作物上，而有关红花中查尔酮异构酶基因的克隆及表达分析尚未见报道。本研究克隆获得了红花中的CHI基因，并对其进行生物信息学分析，以期为提高红花中黄酮化合物的含量及红花代谢调控研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试植物 红花(CarthamustinctoriusL.)“吉红”早熟品种种子购自新疆红花缘科技有限公司。

1.1.2 试 剂 RNA提取试剂盒(RP3301)、反转录试剂盒(RP6601)购自北京百泰克生物技术有限公司；克隆所用载体pEASY-T1 Simple Cloning Kit(CT111-01)购自北京全式金生物技术有限公司；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自爱思进生物技术有限公司；race试剂盒购自罗氏公司；荧光定量试剂盒(RR420A)购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 红花花瓣RNA提取及第一链cDNA的合成 选取红花盛花期花瓣，迅速放于液氮中，用锡箔纸包好后于-80 ℃保存备用。RNA提取按照试剂盒操作说明进行，提取的RNA用核酸检测仪检测其纯度，用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。RNA于-80 ℃保存备用。按照反转录试剂盒的操作说明，进行cDNA的反转录，反转录后的cDNA保存于 -20 ℃冰箱中备用。

1.2.2CHI基因的克隆 根据吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心实验室红花花瓣454测序结果中挑选的候选基因，设计特异性引物，验证CHI基因的中间片段。根据验证的CHI基因中间片段，以红花cDNA为模板，设计引物进行全长基因克隆，所用引物序列见表1。PCR反应体系为：cDNA 1 μL，dNTP Mixture 8 μL，10×LA Buffer 5 μL，Primer F(10 μmol/L) 1 μL，Primer R(10 μmol/L)1 μL，LATaq0.5 μL，ddH2O 33.5 μL，总体积50 μL。PCR反应程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。

1.2.3 PCR产物的克隆与序列分析 将扩增出全长片段的CHI基因PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳上检测，用胶回收试剂盒回收目的片段，将其连接到pEASY-T1 Simple载体上，进行蓝白斑筛选，菌液PCR鉴定和酶切鉴定后，送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序。

将测得的序列利用DNAMAN 软件进行核苷酸序列编辑和氨基酸序列推导，在NCBI 网站上通过BLAST 搜索同源性序列，利用clustalW1.83软件构建系统发育树，用ProtParam 软件(http://web.expasy.org/)分析编码蛋白氨基酸序列的组成、相对分子质量、等电点等理化性质[15]。

1.2.4 实时荧光定量PCR分析 分别提取红花花蕾期、初花期、盛花期和衰落期花瓣RNA，反转录成cDNA用于实时荧光定量分析。定量PCR反应体系为：SYBR Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL，上、下游引物各0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)，DNA模板2 μL，ddH2O 7.2 μL，总体系20 μL。反应程序为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性 3 s，62 ℃退火，40个循环。

2 结果与分析

2.1 红花花瓣总RNA的提取

核酸检测仪检测发现，提取的红花花瓣RNA质量浓度均在1 000 ng/μL左右。1%琼脂糖凝胶电泳检测发现，提取的红花RNA有28S和18S 2条清晰带，且28S条带的亮度约为18S的2倍(图1)。说明RNA提取完整，无降解，可以满足后续试验需要。

2.2 CHI基因中间片段的获取及验证

根据红花花瓣454测序结果拼接比对，获得了CHI基因的中间片段序列，通过RT-PCR扩增出209 bp的中间片段(图2A)，经过胶回收后连接到克隆载体pEASY-T1 Simple上，进一步通过菌液PCR(图2B)和EcoRⅠ、Hand Ⅲ酶切鉴定(图2C)，证实测序结果正确。

2.3 CHI基因cDNA克隆及序列分析

根据CHI基因209 bp的中间片段，以红花花瓣cDNA为模板，分别设计引物进行3′race和5′race克隆，扩增出670 bp的3′端序列和636 bp的5′端序列。将测序结果利用DNAMAN进行拼接，得到红花CHI基因的全长cDNA片段(图3)。图3显示，CHI基因全长cDNA长度为1 161 bp。序列分析表明，该基因的开放阅读框长654 bp，编码217个氨基酸(图4)，5′非翻译区长度为250 bp，3′非翻译区长度为257 bp，含有典型的加尾信号序列AATAA和Poly(A)。该基因所编码的蛋白质理论分子质量约为23.14 ku，等电点(pI)为5.67。带负电荷残基(Asp+Glu)共23个，总的带正电荷残基(Arg+Lys)共20个。将红花CHI基因在NCBI上进行序列比对分析，搜索到青木香(Saussureamedusa)、大丽花(Dahliapinnata)、葡萄(Vitislabrusca)等21个物种的查尔酮异构酶基因，利用clustalW1.83软件进行多重序列比对，并构建系统发育树，结果(图5)表明，红花查尔酮CHI基因与青木香的同源关系最近，达到82%，与菊花和飞蓬的亲缘关系也较近，说明克隆得到的基因确为红花CHI基因。

图3 红花CHI基因全长序列的cDNA克隆
A.CHI基因3′端；B.CHI基因5′端；C.CHI基因全长;M.DL2000 Marker;1.3′race；2.5′race；3～5.cDNA ofCHI
Fig.3 Agarose gel electrophoresis of cDNA ofCHIgene
A.PCR product ofCHIgene 3′ race；B.PCR product ofCHIgene 5′ race；C.PCR product ofCHIgene cDNA;
M.DL2000 Marker;1.3′ race；2.5′race；3-5.cDNA ofCHI

图4 红花CHI基因编码的氨基酸序列
Fig.4 Amino acid sequence ofCHIgene of safflower

2.4 CHI基因在红花中的表达特征

采集红花不同开花时期的花瓣提取RNA，反转录成cDNA，以18S作为内参基因，采用实时荧光定量方法分析CHI基因在红花不同开花时期的表达量，结果见图6。由图6可见，红花CHI基因在花蕾期的表达量最高；其次为衰落期，几乎是初花期表达量的17倍；表达量最低的是初花期。

3 讨 论

CHI基因是黄酮化合物合成途径中的关键酶[16]，其催化查尔酮异构化合成相应的黄酮[17]。本研究通过RT-PCR技术克隆得到红花CHI基因的全长序列，且与其他物种CHI基因有较高的同源性。Park 等[18]研究表明，利用发根系统使黄芩中CHI基因超表达可以提高黄酮化合物的含量。Qin等[6]克隆了葫芦巴CHI基因并在拟南芥突变体中表达，发现转化拟南芥植株的异黄酮含量比野生型拟南芥有较大提高。Zhang等[19]证实，CHI基因在黄酮化合物合成过程中具有重要的作用，甘草CHI基因在甘草发根中过量表达可明显提高黄酮含量，这与CHI基因活性与转录水平的提高直接相关。Li等[7]的试验证实，超表达青木香CHI基因是提高黄酮化合物产量的一个有效方法。

CHI基因存在组织表达特异性，不同组织部位表达不同。银杏[17]CHI基因主要在叶片中表达，促进黄酮化合物积累合成，这与银杏CHI基因启动子区域功能是相关的。而巨峰葡萄[20]CHI基因在幼叶和幼根中都有表达，且在根中的表达受温度诱导。本研究克隆的CHI基因在红花花蕾期表达量最高，表明在花蕾期黄酮化合物的含量可能最高，这为后期研究该基因的超表达提供了理论依据。

4 结 论

从红花中克隆得到了CHI基因的中间片段，进而获得其全长cDNA序列，通过对基因全长序列的生物信息学分析及比对发现，其序列中含有典型的加尾信号序列AATAA和Poly(A)，且与其他物种的CHI基因具有较高的同源性。Real-time PCR结果表明，CHI基因在红花花蕾期的表达量最高，说明该基因相关的黄酮化合物可能在花蕾期积累最多。

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Cloning and expression of Chalcone isomerase gene cDNA ofCarthamustinctorius

LIU Xiu-minga,b,YANG Wen-tinga,b,ZHANG Xue-mengb,JIAO Zhong-dab,YAO Naa,YANG Mei-yingb,GUAN Li-lia,LI Hai-yana,b,LI Xiao-kuna

(aMinistryofEducationEngineeringResearchCenterofBioreactorandPharmaceuticalDevelopment, bCollegeofLifeSciences,JilinAgriculturalUniversity,Changchun，Jilin130118，China)

【Objective】 This study cloned full-length of Chalcone isomerase(CHI)gene in flavonoids biosynthesis fromCarthamustinctoriusand investigated tissue expression specificity to provide reference for the research ofCarthamustinctoriusmetabolic regulation.【Method】 The full-length cDNA ofCHIgene fromCarthamustinctoriuswas cloned using RT-PCR and analyzed using the bioinformatics methods.Phylogenetic tree was constructed for studying homology with similar sequences and the expression at different flowering periods was analyzed by real-time PCR.【Result】 The full-length cDNA ofCHIgene was 1 161 bp with an opening reading frame (ORF) of 654 bp encoding 217 amino acids.The putative protein ofCHIgene had a molecular weight of 23.14 ku and a theoretical pI of 5.67,containing typical AATAA tail signal sequence and Poly(A).Genealogical tree showed thatCHIgene had high homology with other species and the highest value was 82% withSaussureamedusa.Real-time PCR results indicated that relative expression ofCHIgene was highest in bud stage. 【Conclusion】CHIgene was cloned successfully fromCarthamustinctoriusflower,which had highest expression inCarthamustinctoriusbud stage.

Carthamustinctorius;Chalcone isomerase;cDNA cloning;real-time PCR

2014-01-10

国家高技术研究发展计划(863)项目(2011AA100606)；国家自然科学基金项目(31101172,31201237)；吉林省科技厅中青年科技领军人才及优秀创新团队项目(20111815)；教育部博士点基金项目(20122223120002)

刘秀明(1981-)，女，吉林松原人，实验师，主要从事植物生物反应器研究。E-mail:xiuming1211@163.com

李海燕(1971-)，女，吉林舒兰人，教授，博士生导师，主要从事植物抗逆与生物反应器研究。E-mail：hyli99@163.com

时间:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.020

Q786

A

1671-9387(2015)07-0201-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150610.0840.020.html