He-Ne激光辐照对灯盏花组培体系的影响

林丽飞，唐宝林，罗 冰，王传铭，金 秋，刘艳红，张灿邦

(1 云南红河学院 云南省农作物优质高效栽培与安全控制重点实验室，云南 蒙自661100；2 云南农业大学 植物保护学院，云南 昆明650201；3 建水县临安镇农业技术推广中心，云南 建水654399)

He-Ne激光辐照对灯盏花组培体系的影响

林丽飞1，2，唐宝林3，罗 冰1，王传铭1，金 秋1，刘艳红1，张灿邦1

(1 云南红河学院 云南省农作物优质高效栽培与安全控制重点实验室，云南 蒙自661100；2 云南农业大学 植物保护学院，云南 昆明650201；3 建水县临安镇农业技术推广中心，云南 建水654399)

【目的】 研究He-Ne激光辐照不同时间对灯盏花组织培养的影响，为灯盏花的开发利用提供参考。【方法】 以灯盏花的种子、无菌培养苗、叶片、愈伤组织及芽为材料，用He-Ne激光辐照不同时间(种子分别为0(CK)，0.5，1，5，10 min；叶片分别为0(CK)，2，4，6，8 min；愈伤组织分别为0(CK)，1，2，3，4，5，6，7，8 min；分化芽分别为0(CK)，0.5，1，2，3，6 min；根分别为0(CK)，0.5，1，2 min)，分析He-Ne激光辐照对各组织的影响，筛选最佳辐照时间。【结果】 He-Ne激光辐照1 min能够提高灯盏花种子活力；诱导愈伤组织初期，较适宜的辐照时间是2 min，继代后以辐照8 min的愈伤组织生长最好；愈伤组织增殖培养时，辐照4 min效果最佳；诱导芽辐照3 min较适宜；生根培养以辐照2 min较好。【结论】 一定量的He-Ne激光能够提高灯盏花种子的萌发率、出愈率及愈伤组织诱导芽和生根效果。

He-Ne激光；灯盏花；组织培养；生理指标

灯盏花学名短葶飞蓬[Erigeronbreviscapus(Vaniot) Hand.-Mazz]，属菊科(Compositae) 飞蓬属(Erigeron)植物，全草入药，中药名“灯盏细辛”，已入《中华人民共和国药典》，自被1974年出版的《云南省药品标准》收录以来，灯盏花被云南省制药工业广泛用作制药原料，但灯盏花种子瘪粒多，繁殖系数低，难以满足市场需求。

激光诱变于20世纪60年代初兴起， 并在水稻、豆类、花生等许多植物上都取得了重要的进展[1-5]。研究表明，激光辐照可提高种子发芽率、发芽势等，并可改善植物叶片叶绿素含量，提高种子活性，增强光合作用强度和一些生物酶活性，有利于植物生长，从而达到增产的目的[6-13]。当激光作用于生物组织时，在波长、照射时间、能量密度、功率等参量中，照射时间是决定性参量[14]。目前有关激光对灯盏花影响的研究鲜见报道[15]。因此，本试验用He-Ne 激光器，以不同的诱变时间处理灯盏花种子及脱分化组织，选育出了优良细胞系，并对其生理指标进行测定，筛选适宜的照射剂量，以期为灯盏花产业的健康发展及其开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

灯盏花种子购于红河千山生物资源公司，手工拣除其中不饱满的种子和绒毛；灯盏花无菌培养苗、叶片、愈伤组织及芽来自于红河学院组培室，培养条件为：温度(25±2) ℃ ，光照时间16 h/d，光照强度1 500～3 000 lx。

所用仪器：He-Ne激光器(南京教学仪器设备厂)，TU-1901型；OHAUS-AR1140电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)。激光器参数为：波长632.8 nm(电源型号IN-TTL)，光斑直径80 mm，功率1.2 mW，辐照装置如图1所示。

1.2 试验方法

1.2.1 材料消毒与培养基的制备 材料消毒与培养基制备参照文献[16]的方法进行。(1)诱导培养基：MS+2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L；(2)增殖培养基：MS+2，4-D 0.5 mg/L+6-BA 0.1 mg/L；(3)分化培养基：MS+6-BA 0.5 mg/L+10%香蕉汁；(4)生根培养基：1/2MS+NAA 0.3 mg/L。

1.2.2 辐照剂量的优化 选取饱满灯盏花种子及接种好的外植体，用He-Ne激光进行照射处理，辐照时间分别为种子0(CK)，0.5，1，5，10 min；叶片0(CK)，2，4，6，8 min；愈伤组织0(CK)，1，2，3，4，5，6，7，8 min；分化芽0(CK)，0.5，1，2，3，6 min；根0(CK),0.5,1,2 min。辐照时先用反光镜反光，再经过扩束镜使光斑扩大，然后将种子平铺于光斑内进行照射处理[17]。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 种子萌发率 将经激光辐照的灯盏花种子接种到MS培养基上，每天观察种子的萌发情况，计算发芽率、发芽势、发芽速率、发芽指数等相关指标[18-19]，测量数据使用SPSS软件进行分析。

发芽率=正常发芽粒数/供试种子总数×100%；发芽势=规定时间(7 d)内种子发芽数/供试种子总数×100%；发芽速率=∑(Gt×Dt)/发芽率(式中Gt指7 d内种子发芽数，Dt指发芽日数)；发芽指数(GI)=∑Gt/Dt。

1.3.2 愈伤组织出愈率、增长率及诱导芽 将经激光辐照处理的叶片接种到诱导培养基上进行愈伤组织的诱导，培养16和30 d时观察愈伤组织的生长情况，计算出愈率。出愈率=出愈外植体数/接种外植体数×100%。

将试验中辐照时间为0(CK)诱导出的愈伤组织0.5 g接种到增殖培养基上进行激光辐照，培养30 d时测定愈伤组织鲜质量，计算愈伤组织鲜质量增长率。鲜质量增长率=[(培养后的鲜质量-接种时的鲜质量)/接种时的鲜质量]×100%。

将经过增殖培养的愈伤组织接种到分化培养基上，用激光照射0(CK)，0.5，1，2，3，6 min，培养10 和30 d时观察芽生长情况。

1.3.3 生根数 将经激光辐照形成的无根苗接种到生根培养基上，30 d后观察生根情况。

2 结果与分析

2.1 He-Ne激光辐照对灯盏花种子萌发的影响

从表1可以看出，He-Ne激光辐照不同时间对灯盏花种子发芽率、发芽势、发芽指数和发芽速率都会产生影响，随辐照时间延长，上述指标均呈现先增加后降低的趋势，且均在辐照1 min时达到最大值。He-Ne激光辐照处理灯盏花种子的发芽率、发芽势、发芽指数、发芽速率均高于对照，说明He-Ne激光辐照有利于提高灯盏花种子的活力，最佳辐照时间为1 min。

2.2 He-Ne激光辐照对灯盏花叶片诱导愈伤组织的影响

将经He-Ne激光辐照的灯盏花叶片接种于诱导培养基中诱导愈伤组织，结果见表2和图2。由表2和图2可以看出，培养16 d后，均有少量愈伤组织形成，从出愈率看表现为2 min>0 min>8 min>6 min>4 min，从长势上来看表现为2 min>8 min>0 min>6 min>4 min，说明愈伤组织诱导初期较好的辐照时间为2 min；培养30 d后，辐照0(CK)，2，8 min 的出愈率都达到100%，长势较好的为辐照8 min处理，经过继代后愈伤组织的增长量最多，几乎布满整个瓶子，表明继代后经过8 min辐照的愈伤组织长势最好。

2.3 He-Ne激光辐照对灯盏花愈伤组织增长率的影响

从表3可以看出，继代后的灯盏花愈伤组织经He-Ne激光辐照后，愈伤组织的增长呈现不同的趋势。辐照4 min的愈伤组织鲜质量增长率最大，为80.8%，其次为辐照1 min处理，为75.8%，表明4 min的辐照时间对灯盏花愈伤组织的增殖促进作用最强。从表3还可以看出，辐照1，2，4和7 min愈伤组织的鲜质量增加量均高于CK，其中以辐照4 min的愈伤组织鲜质量增加量最大，为2.11 g，其次为1 min处理，达1.57 g。上述结果表明，He-Ne激光辐照4 min有利于愈伤组织的增殖培养。

2.4 He-Ne激光辐照对灯盏花愈伤组织分化培养的影响

从图3可以看出，对辐照后的愈伤组织诱导芽，培养10 d后，辐照时间为0(CK)与3 min的愈伤组织均有芽形成，从芽的长势来看，CK优于3 min处理，从形成的新愈伤组织来看，0.5 min辐照较好，辐照6 min也有新的愈伤组织形成，但是出现了褐化现象。从表4可以看出，培养30 d之后，在辐照3 min处理下芽的长势优于0 min；从愈伤组织的生长看，辐照2 min的有褐化出现，辐照6 min的愈伤组织较紧密，而辐照0.5 min的则只有新的愈伤形成，且形成的愈伤从疏松程度和增殖量来看都比其他处理好。说明He-Ne激光辐照对灯盏花愈伤组织分化有利，3 min的照射时间有利于芽的形成。

2.5 He-Ne激光辐照对灯盏花生根培养的影响

将经He-Ne激光辐照的愈伤组织形成的小植株诱导生根，30 d后辐照2 min处理的长根最多，根为乳白色，细长，几乎布满整个瓶底，植株生长旺盛，长叶较多，长势较好；辐照1 min的长势也好，但次于2 min处理；而辐照0.5 min处理的根短而粗壮，植株生长旺盛，其中有几片叶子较宽、厚，与其他叶片不同(图4)。总体来看，以辐照2 min的长势最好。

3 讨 论

He-Ne激光辐照种子后，种子及其萌发的植物体能产生各种各样的非基因变异性表型效应[14]。本研究结果表明，He-Ne激光辐照灯盏花种子不同时间后，灯盏花种子的发芽率、发芽势、发芽指数、发芽速率均高于对照，说明He-Ne激光辐照有利于提高灯盏花种子的活力，辐照最佳时间为1 min，这与张举成等[15]的研究结果一致。

用He-Ne激光辐照处理的叶片诱导愈伤组织，从出愈率及长势来看，愈伤组织诱导初期辐照2 min诱导效果好，而继代后(30 d)则以辐照8 min的叶片所诱导的愈伤组织长势最好，增殖最快。

在灯盏花愈伤组织的增殖培养中，经He-Ne激光辐照4 min后的愈伤组织较有利于增殖培养；有利于灯盏花愈伤组织分化芽的辐照时间为3 min；生根培养的辐照时间2 min较好。

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Influence of He-Ne laser on tissue culture ofErigeronbreviscapus

LIN Li-fei1,2,TANG Bao-lin3,LUO Bing1,WANG Chuan-ming1, JIN Qiu1,LIU Yan-hong1,ZHANG Can-bang1

(1KeyLabaoratoryforCropHighQualityCutltivationandSecuriyControlofYunnanProvince,YunnanHongheUniversity,Mengzi,Yunnan661100,China;2CollegeofPlantProtection,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming,Yunnan650201,China;3ExtensionCentreofAgro-TechniqueofLin’an,Jianshui,Yunnan654399,China)

【Objective】 Experiment was carried out to study the effects of He-Ne laser on tissue culture system ofErigeronbreviscapusand improveE.breviscapusdevelopment and utilization.【Method】 Seeds,leaves,callus and roots were used as material and different irradiation times were set up.The irradiation times for germination of seed were 0(CK),0.5,1,5,and 10 min,for inducement of leaves were 0(CK),2,4,6,and 8 min,for callus were 0(CK),1,2,3,4,5,6,7,and 8 min,for callus were 0(CK),0.5,1,2,3,and 6 min while for rooting were 0(CK),0.5,1,and 2 min.Then effects of He-Ne laser irradiation were analyzed to select optimum irradiation times.【Result】 The suitable irradiation times for improving seed vigor,early to callus,successive culture to callus,during the multiplication culture,bud inducement,and root were 1 min,2 min,8 min,4 min,3 min,and 2 min,respectively.【Conclusion】 A certain dose of irradiation was suitable to improve rate of germination and growth of callus,shot,and root.

He-Ne laser;Erigeronbreviscapus;tissue culture;physiological indexes

2014-06-26

国家自然科学基金项目(61068003)；云南省应用基础研究项目(2009ZC131M)；第一批红河学院中青年学术带头人后备人才项目(2010PY0104)；红河学院硕士点植物保护一级学科建设项目

林丽飞(1978-)，女，云南建水人，副教授，在读博士，主要从事植物保护、植物细胞工程研究。 E-mail:llf_biology2@126.com

张灿邦(1965-)，男，云南红河人，教授，硕士生导师，主要从事光学物理学研究。E-mail:cbzhanguoh@gmail.com

时间:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.021

S567

A

1671-9387(2015)07-0207-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150610.0840.021.html