溶藻弧菌外膜蛋白OmpK的原核表达及多克隆抗体制备

陈春琳，刘 祥，俱 雄

(陕西理工学院 生物科学与工程学院，陕西 汉中 723001)

溶藻弧菌外膜蛋白OmpK的原核表达及多克隆抗体制备

陈春琳，刘 祥，俱 雄

(陕西理工学院 生物科学与工程学院，陕西 汉中 723001)

【目的】 构建溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核表达载体，优化OmpK蛋白的诱导表达条件，制备OmpK蛋白小鼠多克隆抗体。【方法】 通过PCR扩增获得ompK基因，连接pET-32a质粒构建OmpK-pET32a载体，将其转化大肠杆菌BL21后进行诱导表达。利用切胶纯化获得OmpK蛋白后，免疫小鼠制备OmpK蛋白多克隆抗体，采用ELISA法检测抗体效价，Western-Blotting法检测抗血清特异性。通过正交试验，获得OmpK菌株的最佳诱导表达条件与培养条件。【结果】 PCR扩增获得了长816 bp的ompK基因；成功构建了OmpK-pET32a载体，其诱导表达产物分子质量为30 ku，与预期结果一致。ELISA法获得OmpK抗血清效价达1∶1 600，Western-Blotting试验证实抗血清具有很好的特异性。OmpK菌株最佳诱导表达条件为：菌液OD600值0.8，IPTG终浓度0.3 mmol/L，诱导时间8 h，诱导温度32 ℃；最佳培养条件为：不添加葡萄糖，转速230 r/min，装液量50 mL。【结论】 成功制备了OmpK蛋白多克隆抗体，确定了OmpK蛋白菌株的最佳诱导表达条件与培养条件。

溶藻弧菌；OmpK蛋白；原核表达；多克隆抗体

溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)为革兰氏阴性菌，分布于海域、河口地区，可引起水产鱼类败血症和胃肠炎，造成大量死亡，严重影响水产养殖业的发展[1-2]；它也可引起人类胃肠道疾病与伤口感染，是一种人和海洋动物共感染的病原菌[3]。

外膜蛋白(Outer membrance proteins,OMPs)是弧菌外膜结构的重要组成部分，在感染和诱导宿主免疫反应中起重要作用[1]。试验证实不同种类的弧菌存在多种交叉保护的外膜蛋白抗原[4]，在疫苗的开发中受到人们关注[5]。其中外膜蛋白OmpK(Outer membrance protein K)是弧菌细胞表面的一种组成型蛋白，位于弧菌细胞壁外膜的外层, 与外界存在广泛的接触，为弧菌的主要表面抗原之一[6]。研究发现，OmpK蛋白氨基酸序列在不同弧菌间具有保守性，存在交叉免疫反应，是弧菌间共同抗原的分子基础[7]。OmpK免疫原性已在大黄鱼和点带石斑等海水养殖鱼类中得到验证[8]。此外，OmpK对弧菌感染具有很好的免疫保护作用[9-10]。李梅芳等[11]利用壳聚糖、海藻酸钠包裹副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)OmpK蛋白，成功制备免疫性较好的口服制剂；郑磊等[12]通过构建副溶血弧菌OmpK与鞭毛蛋白的融合蛋白，制备肠溶口服微球疫苗，取得一定的免疫保护效果。可见，OmpK作为水产疫苗有很好的应用前景[13-14]。

本试验构建了溶藻弧菌OmpK蛋白原核表达载体，利用SDS-PAGE电泳切胶方法纯化OmpK蛋白，并用OmpK蛋白免疫小鼠，制备小鼠OmpK抗血清，通过正交试验确定OmpK蛋白表达菌株最适的表达条件与培养条件，为溶藻弧菌OmpK蛋白工业发酵与疫苗开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株、质粒和试验动物 溶藻弧菌、大肠杆菌(E.coli)BL21和DH5α菌株及pET-32a质粒，均由陕西理工学院生化与分子实验中心保存；7只4～5周龄的雄性昆明鼠购于西安交通大学实验动物中心。

1.1.2 主要试剂Taq酶、限制性内切酶、T4-DNA 连接酶、DNA Marker和蛋白标样，均为Takara 公司产品；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒，均为上海生物工程公司产品；IPTG、蛋白胨和酵母粉，购于美国MP公司；HRP标记山羊抗小鼠二抗，购于Sigma公司；引物合成由西安沃尔森生物技术有限公司完成。其他试剂均为国产分析纯级试剂。

1.2 方 法

1.2.1 重组质粒的构建 根据NCBI公布的溶藻弧菌ompK基因序列(GenBank登录号：FJ176400.1)，采用Primer 5软件设计ompK基因引物：Primer 1，5′-ACAGGATCCATGCGTAAATCACTTTT-3′；Primer 2:5′-ACTCTCGAGTTAGAATTTGTAAGTTAC-3′，Primer 1和Primer 2中下划线部分分别为限制性内切酶位点BamHⅠ和XhoⅠ。PCR反应体系为50 μL：反应缓冲液5 μL，溶藻弧菌(OD600约2.0)菌株3 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，25 μmol/L(Primer 1和Primer 2)引物各1.5 μL，Taq酶0.5 μL，补水至50 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性40 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，30个循环；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR片段大小。将PCR产物和pET-32a质粒载体分别进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后，通过T4-DNA连接酶将目的基因插入pET-32a质粒中，转化大肠杆菌DH5α菌株，提取重组质粒后进行BamHⅠ和XhoⅠ 双酶切鉴定，重组质粒测序由西安沃尔森生物技术有限公司完成，最后将重组质粒转入大肠杆菌BL21表达菌株。

1.2.2 蛋白的表达检测与纯化 取重组大肠杆菌BL21菌株过夜培养，以1∶100(体积比)转接入新鲜的LB培养基中，待OD600约为0.6时，加入终浓度0.5 mmol/L IPTG，37 ℃诱导培养5 h，收集菌体，SDS-PAGE电泳检测OmpK蛋白表达情况；并利用切胶的方法对OmpK蛋白进行纯化。

1.2.3 OmpK小鼠多克隆抗体的制备 选用4～5周龄的雄性昆明鼠5只，每只小鼠每次免疫100 μg纯化的OmpK蛋白，对照2只小鼠免疫PBS溶液。首次免疫佐剂采用弗氏完全佐剂，后续免疫佐剂均采用弗氏不完全佐剂。首次免疫14 d后进行第2次免疫，第2次免疫7 d后进行第3次加强免疫。第3次加强免疫后7 d对小鼠眼部取血，并将血液置于4 ℃冰箱中过夜析出血清，离心后去除沉淀，获得的上清溶液即为小鼠OmpK抗血清，最后将血清置于-80 ℃冰箱中保存[15]。

1.2.4 OmpK抗体效价与特异性的检测 利用ELISA法检测抗血清效价[15]，主要步骤为：将纯化的OmpK蛋白定容至5 μg/μL，并将100 μL的OmpK蛋白溶液加入对应的96孔板中，37 ℃ 孵育3 h，加入300 μL封闭液，于37 ℃ 孵育2 h；然后加入100 μL不同稀释倍数的小鼠OmpK抗血清(阴性对照选用PBS免疫的小鼠抗血清)，37 ℃孵育40 min；洗涤后加入100 μL HRP标记山羊抗小鼠二抗(1∶3 000倍体积稀释)，37 ℃孵育40 min；洗涤后加入50 μL底物A(双氧水)与50 μL底物B(TMB)的混合液，37 ℃避光显色10 min，最后加入终止液，450 nm读数。

采用Western-Blotting方法检测OmpK小鼠抗血清特异性[16]，主要步骤为：过夜培养溶藻弧菌，样品处理后SDS-PAGE电泳，转NC膜，加入小鼠OmpK抗血清(稀释度体积比分别为1∶400，1∶800，1∶1 600)，对照加入免疫PBS的小鼠抗血清，洗涤后加入HRP标记山羊抗小鼠二抗(1∶3 000倍体积稀释)，最后DAB显色，通过显色条带的对比确定OmpK抗血清的特异性。

1.2.5 重组蛋白表达条件的优化 为确定OmpK蛋白最佳表达条件，选用L9(34)正交试验模型，对OmpK表达菌株的培养条件与诱导表达条件进行优化，正交试验的因子与水平见表1和表2[17]。

OmpK菌株培养条件正交试验简要过程为：取单菌落加入LB培养液中，培养16 h后，以1∶100(体积比)转接菌体至正交试验要求的新鲜LB培养基中，记录获得的菌液OD600值，试验重复3次。

OmpK菌株诱导表达条件正交试验简要过程为：根据获得的OmpK菌株最适培养条件，快速培养菌液到表2要求的OD600值，再按照正交试验模型的要求，加入不同浓度的IPTG诱导相应的时间，吸取1 mL菌液10 000 r/min 离心1 min，沉淀加入300 μL的2×SDS 蛋白上样缓冲液，煮样5 min，加样10 μL进行SDS-PAGE电泳。最后，采用Phoretix 1D软件对电泳获得的OmpK蛋白表达图谱进行光密度分析。

2 结果与分析

2.1 ompK基因质粒载体的构建

以溶藻弧菌基因组DNA为模板，进行ompK基因的PCR扩增，获得816 bp的基因片段，与预期长度一致(图1-A)。将PCR产物与pET-32a质粒双酶切后，通过T4-DNA连接酶插入pET-32a质粒中，转化大肠杆菌DH5α菌株，提取质粒，用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒获得816 bp片段，与目的基因大小一致(图1-B)；序列测序结果证实扩增片段与NCBI公布的基因序列相同，证明成功构建重组质粒。

2.2 OmpK菌株的表达检测与蛋白纯化

为检测重组蛋白的表达情况，将OmpK表达菌株经IPTG诱导后，蛋白电泳获得约50 ku的蛋白条带(图2)，包含OmpK约30 ku，以及pET-32a质粒自带的20.4 ku 融合蛋白标签，重组蛋白表达情况与预期结果一致；利用SDS-PAGE电泳切胶的方法纯化获得OmpK蛋白(图2)。

2.3 OmpK抗体效价与特异性检测

小鼠经过3次免疫后，获得的OmpK蛋白抗血清经ELISA法测定，发现其抗体效价可以达到1∶1 600(图3)。利用Western-Blotting显色技术，发现不同稀释度OmpK抗血清出现明显条带；而对照阴性抗血清无对应条带(图4)。表明OmpK抗血清可与OmpK蛋白特异性结合，成功制备了OmpK蛋白小鼠抗血清。

2.4 OmpK菌株最适培养条件的正交试验

表达溶藻弧菌OmpK蛋白的大肠杆菌BL21菌株培养条件的正交试验结果见表3，极差分析结果见表4，方差分析结果见表5。表4显示：A1B3C1为OmpK菌株的最佳培养条件，即培养基中不需要加入葡萄糖，转速230 r/min，装液量50 mL；方差分析结果(表5)显示，葡萄糖含量、转速及装液量对OmpK表达菌株培养的影响均达到显著水平。

注：*表示与对照组相比差异显著(P<0.05)。表8同。

Note:*P<0.05 means the difference with control group is significant.The same for table 8.

2.5 OmpK菌株IPTG诱导条件的正交试验

溶藻弧菌OmpK蛋白IPTG诱导表达产物的SDS-PAGE电泳结果见图5。

采用Phoretix 1D软件分析OmpK蛋白表达量的光密度值，结果见表6，极差分析结果见表7，方差分析结果见表8。表7结果显示，最佳OmpK蛋白表达组合为E2F2G2H2，即菌液OD600值为0.8，IPTG终浓度为0.3 mmol/L，诱导时间为8 h，诱导温度为32 ℃。表8结果显示，加IPTG诱导时的菌液浓度对OmpK蛋白表达的影响达到显著水平。

3 讨 论

溶藻弧菌为水产养殖业致病菌，长期以来给水产养殖业造成了巨大的损失[18]。为控制疫情，人们往往滥用抗生素，从而致使溶藻弧菌耐药性增强，同时也影响水产品品质，对水体造成污染。蛋白亚单位疫苗具有无毒、成本低、无耐药性等特点[19-20]，受到人们高度重视。OmpK是溶藻弧菌主要外膜蛋白，具有很强的免疫原性[10]，在水产疫苗上有很好的应用前景[13-14]。本研究成功构建了溶藻弧菌OmpK表达菌株，获得纯化的OmpK蛋白，免疫小鼠后制备了特异性较好的OmpK抗血清，这为研究OmpK蛋白功能与疫苗开发奠定了基础。

本研究通过设计正交试验模型，成功地对溶藻弧菌OmpK蛋白的表达条件进行了研究：(1)未诱导时，OmpK菌株最佳培养条件为A1B3C1，即不加葡萄糖，转速230 r/min，装液量50 mL；(2)IPTG诱导后，OmpK蛋白最佳表达条件为E2F2G2H2，即菌液OD600值0.8，IPTG终浓度0.3 mmol/L，诱导时间8 h，诱导温度32 ℃。Xu等[21]发现，提高培养基转速可增加菌体对氧气与营养的摄取，有利于菌株的生长，这与本试验结果一致。IPTG具有毒性[22]，实际生产中应采用低浓度IPTG诱导。此外，合适的诱导时间有利于蛋白的合成[23]，相对于盲目设定诱导时间，节约了生产成本；因而，在工程菌发酵上应采用合适的诱导时间。此外，低温诱导利于蛋白表达[23-24]，与本研究结果一致。因而，OmpK工程菌蛋白发酵可按2步法进行：(1)IPTG诱导前，提高培养基转速使菌体快速生长到诱导浓度；(2)IPTG诱导后，可在菌株对数生长中期加入低浓度IPTG诱导，低温且诱导时间不易过长。

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Prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of outer membrane protein OmpK inVibrioalginolyticus

CHEN Chun-lin,LIU Xiang,JU Xiong

(CollegeofBiologicalSciencesandEngineering,ShaanxiUniversityofTechnology,Hanzhong,Shaanxi723001,China)

【Objective】 This study aimed to construct prokaryotic expression vector ofVibrioalginolyticusouter membrane protein K (OmpK),optimize the expression condition of OmpK,and prepare the polyclonal antibodies of mouse anti-OmpK.【Method】ompKgene was obtained by PCR amplification before being connected to pET-32a plasmid for OmpK-pET32a vector.Then,the vector was transformed toE.coliBL21 for OmpK protein expression strain.OmpK was purified by the gel slicing method,and the polyclonal antibody was prepared using immunized mice.The antibody titer and specificity were detected by ELISA and Western-Blotting,respectively.The optimal inducing and culturing conditions were also gained by orthogonal experiment.【Result】 PCR amplification obtained 816 bpompKgene.OmpK-pET32a vector was constructed successfully,and the induced expression product was 30 ku.The OmpK antibody titer was 1∶1 600 obtained by ELISA,and Western-Blotting proved that the antiserum had good specificity.The optimal inducing conditions for OmpK protein expression were:strain OD600value,IPTG final concentration,inducing time and temperature were 0.8,0.3 mmol/L,8 h,and 32 ℃,respectively while the optimal culturing conditions were:rotation rate,glucose concentration,and medium volume were 230 r/min,0 glucose and 50 mL,respectively.【Conclusion】 The OmpK polyclonal antibodies were successfully prepared and the optimal inducing and culturing conditions were obtained.

Vibrioalginolyticus;OmpK protein;prokaryotic expression;polyclonal antibody

2014-06-26

陕西省教育厅科学研究计划项目(2013JK0723)；陕西理工学院人才启动项目(SLGQD13-15)

陈春琳(1982-)，女，安徽合肥人，硕士，主要从事分子生物学研究。E-mail:chchl888@163.com

刘 祥(1983-)，男，安徽合肥人，讲师，博士，主要从事蛋白质组学与免疫学研究。E-mail:liuxiang888525@163.com

时间:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.022

Q78

A

1671-9387(2015)07-0007-08

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150610.0840.022.html