NDV、KLT及其联用时小鼠H22肝癌瘤组织的病理变化与TNF-α表达的研究

周 琳，张 琪，梁 帅，余关林，赵善廷，许信刚

(西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100)

NDV、KLT及其联用时小鼠H22肝癌瘤组织的病理变化与TNF-α表达的研究

周 琳，张 琪，梁 帅，余关林，赵善廷，许信刚

(西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100)

【目的】 研究新城疫病毒(New Castle Disease Virus，NDV)、康莱特注射液 (Kanglaite Injection，KLT)及NDV+KLT联用治疗肝癌肿瘤过程中，癌组织的病理变化以及肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)在肿瘤组织中的表达情况，探究TNF-α在抗肿瘤过程中的作用，为应用生物素治疗肿瘤提供一定的理论依据。【方法】 建立小鼠H22肝癌肿瘤模型，将96只荷瘤小鼠随机均分成生理盐水对照组(0.8 mL/只)、NDV治疗组(0.8 mL/只)、KLT治疗组(0.5 mL/只)及NDV+KLT联合治疗组共4组，分别在治疗后的4，8，12和16 d取小鼠肿瘤组织制作2套石蜡切片，一套进行HE染色检测病理变化；另一套进行免疫组织化学SP观察TNF-α的表达情况。【结果】 HE染色发现，与对照组相比， NDV组和KLT组都有明显的肿瘤生长抑制及肿瘤细胞坏死现象，特别是NDV+KLT联合治疗组的治疗效果显著；免疫组化研究结果表明，不同的治疗组TNF-α分布差异显著，其中NDV+KLT联合治疗组的阳性反应最强，其次是KLT治疗组。【结论】 NDV和KLT的抗肿瘤作用与TNF-α细胞因子表达有一定的相关性，其中NDV+KLT联合治疗的抗肿瘤效果最好。

TNF-α；NDV；KLT；H22肝癌

20世纪50年代，人们发现新城疫病毒(New Castle Disease Virus,NDV)具有抑制晚期胃癌细胞转移的作用，且只特异性地杀伤肿瘤细胞，对人正常成纤维细胞没有影响[1]。此后，NDV作为新型的抗肿瘤制剂被国内外学者广泛研究，国外已将新城疫病毒应用于临床生物治疗[2]。NDV的抗肿瘤效应是多方面的，其能直接杀伤肿瘤细胞、增强机体细胞免疫功能及诱导细胞因子的产生，如干扰素、肿瘤坏死因子、白细胞介素、单核细胞集落刺激因子等[3]。康莱特注射液(Kanglaite Injection,KLT)是以从薏苡仁中提取的天然有效抗癌活性物质——薏苡仁油为原料，通过先进制剂工艺研制而成的可供静、动脉直接大剂量输注的新型脂肪乳剂[4]。研究证实，KLT对体内外多种肿瘤细胞具有较强的杀伤和抑制效果，且无明显不良反应，已用于多种恶性肿瘤的临床治疗，是一种临床运用效果较好的抗肿瘤药物[5-6]。

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)主要由活化的单核/巨噬细胞产生，是迄今为止发现的抗肿瘤作用最强的生物因子[7-8]，具有明显的细胞毒作用，对肿瘤有抑制作用。TNF-α的抗肿瘤机制很复杂，TNF-α可以通过与靶细胞膜上的肿瘤坏死因子受体(TNFR)结合，发挥细胞毒性、抗病毒、免疫调节等生物活性[9]；还可通过引发细胞免疫与体液免疫，增强宿主免疫功能[10]，进而阻断肿瘤血管的生成[11]，抑制肿瘤的生长。TNF-α还可提高抗肿瘤药物的疗效[12-14]，临床上联合使用TNF-α可以明显增强化疗药物的疗效，却不增加毒性，但机制还不甚明确。本试验构建了小鼠肝癌肿瘤模型，用NDV、KLT和NDV+KLT治疗荷瘤小鼠，运用HE染色和免疫组化方法，观察肿瘤组织的病理变化及TNF-α的分布差异情况，以期从形态学上阐明NDV和KLT联合治疗肿瘤的效果，以期为利用二者治疗肿瘤提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验动物和瘤株 昆明种雌性小白鼠96只(体质量18～22 g/只)和H22肝癌瘤源，均购自第四军医大学实验动物中心。

1.1.2 病毒、药品及主要试剂 NDV弱毒，由西北农林科技大学动物医学院兽医微生物实验室提供，血凝价(HA)29；康莱特注射液，购自浙江省康莱特药业有限公司(生产批号：1107161-2)；TNF-α抗体，购自武汉博士德生物工程有限公司(产品货号：BAO131)；APES、抗原修复液，购自福州迈新生物技术开发有限公司；免疫组化试剂盒，购自北京四正柏生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 肿瘤模型的建立 将瘤细胞H22用Hank’s液稀释至4×107个/mL，小白鼠左前肢腋下注射瘤细胞悬液，皮下注射，注射剂量为0.1 mL/只。

1.2.2 试验分组及用药 自建立肿瘤模型当日起，将96只荷瘤小鼠随机平均分成4组，Ⅰ组：阴性对照组，皮下注射生理盐水0.8 mL/只；Ⅱ组：NDV治疗组，皮下注射NDV弱毒0.8 mL/只；Ⅲ组：KLT注射液治疗组，腹腔注射KLT注射液0.5 mL/只；Ⅳ组：NDV+KLT注射液联用组，皮下注射NDV弱毒0.8 mL/只，腹腔注射KLT注射液0.5 mL/只。KLT注射液每日注射，NDV弱毒和生理盐水均隔日注射。

1.2.3 HE染色及免疫组化 分别在4，8，12和16 d，每组各取6只携瘤小鼠，腹腔注射体积分数10%水合氯醛0.1 mL/只麻醉。心脏灌注后，取小鼠的肿瘤组织，置于体积分数4%多聚甲醛磷酸缓冲液中固定24 h以上，组织经脱水、透明、浸蜡、包埋后，做连续切片(片厚5 μm)。试验共制作2套切片，一套切片做HE染色，检测肿瘤微环境动态变化；另一套按免疫组化试剂盒说明，检测TNF-α分布差异情况。

2 结果与分析

2.1 肿瘤组织的病理组织学变化

2.1.1 4 d病理组织学变化 4 d时，Ⅰ组肿瘤组织生长旺盛，肿瘤细胞数量很多，胞核胞质染色很深，核质比较高，嗜碱性强，异型性高，伴有少量炎性细胞浸润(图1-A)。Ⅱ组肿瘤组织生长不旺盛，胞核嗜碱性强，胞质弱嗜酸性，部分肿瘤细胞发生核固缩、核裂解，出现变性坏死区，有较多数的巨噬细胞和淋巴细胞浸润(图1-B)。Ⅲ组肿瘤组织总体生长较慢，但靠近肌肉组织部位生长相对旺盛，肿瘤细胞嗜碱性强，大面积的变性坏死区肿瘤细胞胞质嗜酸性较强，并有较大量的淋巴细胞和其他的炎性细胞浸润(图1-C)。Ⅳ组肿瘤组织生长缓慢，肿瘤细胞异型性下降，出现大面积坏死区和空泡变性区，坏死区大部分肿瘤细胞核裂解并溶解，有炎性细胞带(图1-D)。

2.1.2 8 d病理组织学变化 8 d时，Ⅰ组肿瘤组织生长旺盛，肿瘤细胞数量多，呈浸润性生长，侵入到肌肉组织，异型性很高，胞核胞质着色很深，嗜碱性很强(图2-A)。Ⅱ组肿瘤组织生长较为旺盛，肿瘤细胞浸润到肌肉组织，出现变性坏死区，其肿瘤细胞核固缩、核裂解，且嗜酸性增强，未发生变性坏死区肿瘤细胞生长旺盛，也可见肿瘤细胞发生坏死(图2-B)。Ⅲ组肿瘤组织生长较旺盛，出现较大面积的变性坏死区和空泡，肿瘤细胞溶解，未发生坏死区肿瘤细胞生长旺盛，嗜酸性增强，坏死区可见较大量的淋巴细胞和其他的炎性细胞浸润(图2-C)。Ⅳ组肿瘤组织出现大面积坏死区和大量空泡，坏死区大部分肿瘤细胞溶解，未发生坏死区肿瘤细胞生长仍相对旺盛，有大量巨噬细胞及其他的炎性细胞浸润(图2-D)。

2.1.3 12 d病理组织学变化 12 d时，Ⅰ组肿瘤组织生长旺盛，呈浸润性生长，在肿瘤组织生长旺盛部位肿瘤细胞异型性很高，出现变性坏死，可见少量的空泡(图3-A)。Ⅱ组肿瘤组织生长不旺盛，出现大面积变性坏死区和空泡，肿瘤细胞异型性下降，胞质胞核嗜酸性增强，在坏死区可见淋巴细胞浸润(图3-B)。Ⅲ组肿瘤组织生长不旺盛，出现大面积变性坏死和空泡区，多数肿瘤细胞发生坏死溶解，胞核胞质呈弱嗜酸性，有明显的核固缩、核裂解现象(图3-C)。Ⅳ组肿瘤组织整体嗜酸性增强，出现大面积坏死区，肿瘤细胞大部分坏死溶解，肿瘤细胞嗜酸性较强(图3-D)。

2.1.4 16 d病理组织学变化 16 d时，Ⅰ组肿瘤组织生长旺盛，胞核胞质嗜碱性较强，肿瘤细胞异型性降低，可见空泡变性，部分细胞死亡，出现坏死区域(图4-A)。Ⅱ组肿瘤组织生长缓慢，大量肿瘤细胞核固缩、核溶解，且嗜酸性增强，有大面积坏死区(图4-B)。Ⅲ组肿瘤组织生长不旺盛，肿瘤细胞大面积坏死，胞核空泡变性或裂解，大量肿瘤细胞嗜酸性增强，坏死区的肿瘤细胞多数溶解(图4-C)。Ⅳ组肿瘤组织几乎不生长，大量瘤细胞溶解，细胞较小，嗜酸性很强，呈现大量空泡变性，坏死区可见炎症细胞也大量的溶解(图4-D)。

2.2 TNF-α在肿瘤组织中的表达情况

免疫组化SP法染色的切片，背景无色，若免疫阳性产物为浅棕色或者浅黄色，对照组切片染色为阴性，则说明试验具有免疫反应的特异性。根据染色的深浅可分为弱阳性(着色浅，+)、阳性(中等着色，++)、强阳性(着色深，+++)三级。本试验对照组染色均为阴性，说明免疫组化SP法具有 TNF-α 免疫反应的特异性。

2.2.1 4 d时TNF-α的表达情况 4 d时，Ⅰ组肿瘤组织不着色或者着色很浅，呈现微弱的弱阳性，仅有少数细胞膜呈弱阳性(+)(图5-A)。Ⅱ 组肿瘤组织坏死区域呈阳性(++)，空泡边缘及坏死区肿瘤细胞阳性反应较强，坏死区细胞基质中可见丰富的被淡染的胶原纤维，肿瘤组织生长旺盛区肿瘤细胞膜呈现较强的阳性，胞质呈微弱的弱阳性(图5-B)。Ⅲ组肿瘤组织中等着色，呈现为阳性反应(++)，阳性细胞数较多，胞质呈阳性反应，巨噬细胞和炎性细胞也表现为较强的阳性反应。基质中的胶原纤维丰富(图5-C)。Ⅳ 组肿瘤组织着色较深，呈现为阳性(++)，炎性细胞数很多，胞膜、胞质呈现强阳性反应(+++)；空泡边缘及周围肿瘤细胞都呈阳性反应，基质中丰富的胶原纤维和血管也呈阳性反应(图5-D)。

2.2.2 8 d时TNF-α的表达情况 8 d时，Ⅰ组肿瘤组织不着色或着色较浅，仅空泡边缘的细胞膜可见微弱的着色，呈现为微弱的弱阳性(+)(图6-A)。Ⅱ组肿瘤组织整体着色微浅棕黄色，大多数肿瘤细胞膜和细胞质都呈弱阳性反应(+)，少数肿瘤细胞和炎性细胞呈阳性反应(++)，空泡边缘及血管组织呈阳性反应(图6-B)。Ⅲ组肿瘤组织着色较浅，呈现为阳性反应(++)，肿瘤细胞多数为阳性，胞膜着色相对较深，在空泡变性区边缘着色相对较深，炎性细胞也表现为较强的阳性，坏死区可见染色较浅的胶原纤维(图6-C)。Ⅳ组肿瘤组织着色较其他组深，呈现为强阳性反应(+++)，空泡区边缘着色较深，肿瘤细胞生长旺盛区仅见胞膜呈阳性，胞质为弱阳性(图6-D)。

2.2.3 12 d时TNF-α的表达情况 12 d时，Ⅰ组肿瘤组织着色较浅，呈现弱阳性反应(+)，少数肿瘤细胞膜呈弱阳性反应，肿瘤组织边缘坏死区基质中可见淡染为浅黄色的胶原纤维(图7-A)。Ⅱ组肿瘤组织着色较深，肿瘤细胞膜、细胞质均呈较强阳性表达(++)，空泡区边缘及周围肿瘤细胞阳性，肿瘤细胞生长区阳性较坏死溶解区阳性强(图7-B)。Ⅲ组肿瘤组织整体呈现较强阳性反应(++)，肿瘤细胞生长区可见胞膜胞质呈较强阳性，还可见肿瘤细胞间连接有丰富的胶原纤维，血管组织染色较深，呈阳性反应，肿瘤细胞坏死区呈弱阳性(+)(图7-C)。Ⅳ组肿瘤组织呈现强阳性反应(+++)，肿瘤细胞溶解坏死区着色很深，肿瘤细胞的胞膜胞质均呈强阳性，有大量呈强阳性的炎性细胞，这些细胞中间分布着许多着色很浅的胶原纤维(图7-D)。

2.2.4 16 d时TNF-α的表达情况 16 d时，Ⅰ肿瘤组织着色浅，呈现弱阳性反应(+)，少数肿瘤细胞膜呈阳性反应，坏死区较生长区着色稍深(图8-A)。Ⅱ组肿瘤细胞呈现阳性表达(++)，肿瘤细胞胞膜呈阳性反应，胞质弱阳性，坏死溶解区有许多胶原纤维呈阳性(图8-B)。Ⅲ组肿瘤组织整体呈现较强阳性反应(++)，肿瘤细胞胞膜胞质着色深，呈强阳性反应(+++)，坏死区肿瘤细胞着色相对较浅，呈阳性反应，基质中血管组织及周围细胞呈强阳性反应(图8-C)。Ⅳ组肿瘤组织着色浅，呈现弱阳性反应(+)，肿瘤细胞膜可见微弱的阳性，坏死溶解的肿瘤细胞和炎性细胞都几乎不着色(图8-D)。

3 讨 论

NDV、KLT注射液均有抗肿瘤的作用，有研究已经证实NDV+KLT联合作用抗肿瘤效果更强[15]。NDV抗肿瘤作用机制尚不完全清楚，迄今为止的研究表明，NDV感染机体后能够诱导机体产生如干扰素、肿瘤坏死因子、白细胞介素、单核细胞集落刺激因子等细胞因子[3]，大量文献表明NDV能够诱导机体产生TNF-α，其可以通过诱导肿瘤细胞程序性死亡、作用于肿瘤血管内皮细胞，在破坏肿瘤组织血管、增加抗肿瘤药物疗效、降低对肿瘤细胞的耐药性、介导免疫调节等方面发挥作用[8]。KLT注射液在我国中医临床治疗肿瘤中被广泛应用，其主要抗癌活性成分是薏苡仁中的薏苡仁甘油酯，近几十年的临床试验表明，康莱特注射液对提高治疗效果、改善病人的生活质量和延长生存期及降低化疗药物的不良反应、调整机体状况、提高机体的免疫功能具有非常重要的意义[16]。其发挥作用的药理基础是能够阻滞G2+M期时相细胞，并导致细胞百分比下降，减少有丝分裂，致使DNA合成减少，肿瘤细胞增殖受抑，并激活促细胞凋亡因子，诱导细胞凋亡，从而起到抑制肿瘤发展的作用[17]。KLT不仅具有抗肿瘤作用，还能够提高机体免疫力，这是其抗肿瘤的一大优势。

本试验从病理组织学角度观察发现，对照组肿瘤生长旺盛，浸润到肌肉组织，治疗组相对生长缓慢，到12和16 d表现为不生长和肿瘤细胞大量坏死。NDV组8，12和16 d肿瘤细胞的异型性降低，嗜酸性增强，出现核固缩、核裂解现象，空泡区和坏死面积比对照组大得多，8和12 d时炎性细胞数量也较多，细胞质嗜酸性逐渐增强。KLT组在12和16 d时，肿瘤细胞大量坏死溶解，可见大面积坏死区，与NDV组同一时间相比，KLT组肿瘤组织坏死稍加明显。NDV+KLT组在4，8，12和16 d均表现为肿瘤细胞大量坏死，坏死部位细胞嗜酸性明显增强，坏死区域面积很大，在8和12 d时可见大量的淋巴细胞和巨噬细胞浸润，16 d时表现为肿瘤细胞和炎性细胞的大量坏死，肿瘤组织嗜酸性很强。由此表明，NDV和KLT都具有较好的抑制肿瘤生长的作用，且两者联合使用治疗效果更好。免疫组化SP法观察TNF-α的表达情况发现，各组均有表达，在4，8和12 d时TNF-α在坏死区阳性反应比生长旺盛区肿瘤组织强，NDV+KLT组在4和12 d时出现大量巨噬细胞和淋巴细胞呈强阳性表达，肿瘤生长旺盛区表达很弱，在16 d时可见大量坏死区表现为弱阳性甚至阴性。NDV+KLT 组相比于其他治疗组，阳性反应更加明显，其次就是KLT治疗组，此结果反映的情况与HE染色结果相一致。由此分析，NDV和KLT 能够刺激机体中TNF-α产生，并发挥抗肿瘤作用，引起肿瘤细胞变性坏死，而作用后期，TNF-α的表达量又下降，据此可推测，TNF-α参与了肿瘤组织的生长、转移和凋亡过程，与肿瘤细胞的凋亡存在一定的关系。这也进一步证明了NDV的抗肿瘤作用机制之一是与细胞因子密切相关。前人的研究已证实，TNF-α可以作用于肿瘤血管内皮细胞，导致血管功能的紊乱[8]，从而达到抑制肿瘤生长的作用。本研究还发现，肿瘤血管内皮细胞在不同的作用时间和不同药物治疗下，TNF-α的表达情况具有明显差异，说明肿瘤的生长与血管的生成有很大关联。免疫组化试验各组中胶原纤维的阳性表达情况也很不相同，胶原纤维是由成纤维细胞产生的，成纤维细胞在机体损伤修复时会明显增多，形成胶原纤维，这提示胶原纤维的形成与肿瘤组织生长或坏死有一定的相关性。本试验结果表明，KLT和NDV抗肿瘤作用与细胞因子的分泌有密切关系，这将为人类利用生物因素治疗肿瘤提供一定的理论依据，但其深层作用机制很复杂，还有待进一步深入探究。

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Effects of NDV,KLT and their combination on pathological changes of tumor tissue and expression of TNF-α of mice with H22liver cancer

ZHOU Lin,ZHANG Qi,LIANG Shuai,YU Guan-lin,ZHAO Shan-ting,XU Xin-gang

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study used New Castle Disease Virus (NDV),Kanglaite Injection (KLT) and their combination to treat liver cancer.The pathological changes of tumor tissue and expression of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) were analyzed to understand the function of TNF-α in cancer treatment.【Method】 Mice H22tumor model was established with 96 tumor-bearing mice randomly divided into four groups,NS control group (0.8 mL),NDV treatment group (0.8 mL),KLT treatment group (0.5 mL) and NDV+KLT treatment group.Tumor tissue was obtained from every group in the 4,8,12 and 16 d respectively.Paraffin sections were made to observe pathological changes using hematoxylin-eosin (HE) staining and expression of TNF-α using immunohistochemistry SP method.【Result】 HE staining showed that,compared with NS control group,tumor growth inhibition and tumor cells necrosis appeared,especially NDV+KLT treatment group had significant treatment effect.Compared with NS control group,pathological changes of tumor tissue and distribution of TNF-α were significantly different in all treatment groups,especially in NDV+KLT group.NDV+KLT group also had the strongest positive reaction,followed by KLT treatment group.【Conclusion】 Anti-tumor effect of NDV and KLT was related to expression of TNF-α and combination of NDV and KLT had the best effect.

TNF-α;NDV;KLT;H22liver cancer

2014-01-10

西北农林科技大学基本科研业务费项目(Z109021427)；西北农林科技大学博士科研启动基金项目(Z109021116)

周 琳(1987-)，女，河南济源人，在读硕士，主要从事预防兽医学研究。E-mail：zhouyan15191901947@163.com

许信刚(1974-)，男，陕西咸阳人，副教授，主要从事预防兽医学研究。E-mail：286567031@qq.com

时间:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.026

S852.3

A

1671-9387(2015)07-0015-09

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150610.0840.026.html