复合益生菌生物消毒剂的制备及其在肉鸭生产中的应用

席 磊,王永芬,石志芳,范佳英,赵芙蓉

(1 河南牧业经济学院 a 畜牧工程系，b 生物工程系，河南 郑州 450011；2 河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳471003)

复合益生菌生物消毒剂的制备及其在肉鸭生产中的应用

席 磊1a,王永芬1b,石志芳1a,范佳英1a,赵芙蓉2

(1 河南牧业经济学院 a 畜牧工程系，b 生物工程系，河南 郑州 450011；2 河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳471003)

【目的】 研制复合益生菌生物消毒剂，探讨其对鸭舍环境、肉鸭生产性能及健康状况的影响。【方法】 以枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、酵母菌为材料，通过3因素4水平正交试验筛选3株益生菌的最佳复配比例，据此制备复合益生菌生物消毒剂，确定其喷雾消毒周期。选取4日龄樱桃谷肉鸭600只，随机分为对照组、苯扎溴铵消毒组(试验1组)和复合益生菌生物消毒剂消毒组(试验2组)，检测各组鸭舍中环境活菌数、有害气体含量、鸭生产性能、免疫功能及肠道菌群等指标。【结果】 与苯扎溴铵相比，复合益生菌生物消毒剂使鸭舍NH3含量与活菌数分别下降42.21%和24.65%(P<0.05)，平均日增质量提高8.58%(P<0.05)，料肉比降低5.36%(P<0.05)；肉鸭脾脏指数、胸腺指数分别提高35.94%和15.41%(P<0.05)，盲肠乳酸杆菌数量提高7.96%(P<0.05)，大肠杆菌数量降低5.49%(P<0.05)。【结论】 复合益生菌生物消毒剂较苯扎溴铵能更好地改善鸭舍环境、提高肉鸭生产性能与免疫性能。

复合益生菌；生物消毒剂；鸭舍环境；生产性能；免疫性能

我国畜禽养殖业的快速发展带来了严重的环境污染问题，其中病原微生物污染是影响畜禽舍环境质量的重要因素[1]。研究表明，畜禽舍环境中的微生物含量与疾病发病率有着显著的关系[2-5]，给畜禽生产和人类健康带来了严重的威胁。因此，降低畜禽舍环境中的微生物水平，是控制疾病流行、净化养殖环境的关键环节。定期消毒是目前畜禽舍环境净化的重要措施，消毒的方式主要有冲洗、浸液、紫外和喷雾等4种方式，常用消毒剂为含氯、有机碘混合物或酚类等的化学消毒剂。然而，随着化学消毒剂的大量使用，其潜在的化学毒性、腐蚀性、不稳定性以及细菌耐药性等问题日益凸显[6-8]。因此，研发绿色环保的生物消毒剂改善畜禽舍环境、控制病原微生物，对于提高畜禽健康水平，促进畜牧业健康发展显得尤为重要。

益生菌以天然无毒、无副作用、无残留，可以促进机体微生态平衡、抑制有害菌生长等优势已经成为畜牧业研究的热点[9-10]。目前，益生菌不仅作为一种新型绿色饲料添加剂在提高畜禽生产性能方面显示了良好的应用效果[11-13]，而且在发酵床养殖模式中通过对垫料和畜禽粪便的协同发酵，促进了养殖环境净化与畜禽健康[14-15]。辛国芹等[16]报道，使用抗菌肽与乳酸菌混合制剂进行肉鸡场环境消毒，可显著提高肉鸡生产性能及免疫性能；陈静等[17]报道，微生态喷雾剂可以有效降低蛋鸡舍NH3和H2S含量；仝永娟[18]报道，规模化肉鸡舍喷洒芽孢杆菌复合制剂可以有效抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的数量，并对鸡只的生长和免疫健康有一定的促进作用。然而，利用益生菌对规模化鸭场进行生物消毒的研究尚鲜见报道。本研究以项目组前期从河南某规模肉鸭场分离鉴定获得的3种益生菌菌株为材料，基于不同益生菌的协同作用，研制复合益生菌生物消毒剂，并以常规化学消毒剂为对照，对其实际应用效果进行了考察，以期为利用益生菌进行畜禽舍生物消毒提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验菌株 枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、酵母菌3种益生菌株，由河南牧业经济学院微生物技术实验室从规模鸭场分离鉴定获得。指示菌大肠埃希氏菌(Escherichiacoli，CVCC1570)，购于国家兽医微生物菌种保藏中心。

1.1.2 化学消毒剂 百毒杀(苯扎溴铵)，购自贝康生物科技有限公司。

1.1.3 培养基 常规营养琼脂、YPD和LB等培养基，购自北京奥博星生物技术责任有限公司。

1.1.4 主要设备 PX-250B型生化培养箱(上海跃进医疗器械厂)；HZQ-Q型摇床(哈尔滨东联电子技术开发有限公司)；BMR系列中试发酵罐(50 L)(上海傲中生物工程设备有限公司)；QC-2B双气路大气采样仪(北京启宏瑞达科技有限公司)。

1.2 复合益生菌生物消毒剂的制备

1.2.1 单一益生菌制剂的制备 按照王永芬等[19]的方法，首先对枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、酵母菌3种益生菌菌株分别进行活化与种子培养；然后将其种子培养液按体积分数5%的接种量分别接种到相应的50 L发酵罐中进行发酵培养，其中枯草芽孢杆菌的培养温度为35 ℃，初始pH 7.0，转速120 r/min，通气量1.1 vvm，24 h后每隔2 h取样1次，测定产芽孢率，当产芽孢率达到90%以上时停止发酵；乳酸杆菌的培养温度为37 ℃，初始pH 6.5，培养时间28 h；酵母菌的培养温度为28 ℃，初始pH 6.0，转速120 r/min，通气量0.8 vvm，培养时间48 h。发酵结束后，使用0.2 μm微滤膜分别对3种益生菌发酵液进行浓缩，用稀释平板法检测产品活菌数，要求活菌数不少于1×1011CFU/mL。

1.2.2 复合益生菌生物消毒剂的制备 首先以大肠埃希氏菌为指示菌，测定3种单一益生菌制剂的最佳抑菌浓度。然后采用3因素4水平正交试验，选用正交表L16(45)安排试验因素和水平，试验设计见表1，筛选出复合益生菌制剂的最优水平组合，制备复合益生菌生物消毒剂。

1.3 复合益生菌生物消毒剂喷雾消毒周期的确定

试验在河南濮阳某规模鸭场常规饲养管理的鸭舍进行。从4日龄开始持续到39日龄，各日龄鸭舍使用制备的复合益生菌生物消毒剂消毒，消毒后每隔24 h采用自然沉降法测定鸭舍环境中的微生物活菌数。以《畜禽场环境质量标准》(NY/T 388-1999)中规定的禽舍环境细菌数不超过25 000 CFU/m3为标准[20]，当鸭舍内微生物活菌数大于 25 000 CFU/m3时，即需要再次消毒，2次消毒间隔的时间即为复合益生菌生物消毒剂的消毒周期。每次消毒的时间为13:00，使用高压动力喷雾器消毒30 min，雾粒大小控制在80～120 μm，喷雾离鸭体50 cm左右，喷雾量20 mL/m3。喷雾时按由上至下、由内至外的顺序进行，其中免疫前后3 d停止消毒。

1.4 复合益生菌生物消毒剂的应用效果检测

1.4.1 试验设计 试验在河南濮阳某规模鸭场进行。采用单因子3水平4重复试验设计，选择个体质量相近的4日龄樱桃谷肉鸭600只，随机分为对照组、试验1组和试验2组。各试验组肉鸭饲养在同一栋鸭舍，每组间用木板进行分割，形成3个相等的独立空间，每个空间再用0.30 m高的隔栏分隔成4个面积相等的饲养鸭圈(4个重复)，每个重复50只鸭。对照组不作任何消毒处理；试验1组为化学消毒组，按照鸭场常规采用0.02%苯扎溴铵溶液进行消毒，每2 d消毒1次；试验2组为生物消毒组，采用制备的复合益生菌生物消毒剂按照1.3节确定的消毒周期进行消毒。试验采用全期网上平养，自由采食，24 h光照。各组饲养管理方式、免疫程序均按常规要求进行，基础日粮具体成分及营养水平按照文献[21]进行配制，试验期35 d。

1.4.2 鸭舍环境空气质量的测定 各试验组每个重复按照四角及对角线交点的方式确定5个点，试验期间连续5周于每试验周最后一天下午17：00，分别由同一人在鸭舍内使用双气路大气采样仪采集空气样本，采样高度为0.20 m。NH3、H2S、CO2含量分别采用纳氏试剂分光光度法、碘量法、容量滴定法测定。同时，在各气体采样点采用自然沉降法进行鸭舍空气细菌的采样，采样高度距离地面60 cm。具体方法：每点放置1个普通营养琼脂培养平皿，移去平皿盖，使平皿暴露在鸭舍空气中，5 min后盖上平皿；将采样后的培养皿放置在恒温培养箱培养24 h，记录培养皿中的细菌菌落数，计算鸭舍内空气活菌总数。空气菌落数(CFU/m3)=N×50 000/QT，其中N为所有平皿菌落数，T为采样时间(min)，Q为培养皿面积(cm2)。

1.4.3 肉鸭生产指标的测定 每天统计肉鸭采食量，记录肉鸭健康状况，统计发病率(Incidence rate，IR)；每试验周最后一天早晨喂料前，从每试验组随机选取20只鸭(每重复5只)逐只称体质量，计算每周肉鸭的平均日增质量(Average daily gain，ADG)、平均日采食量(Average daily feed intake，ADFI)和料肉比(Feed/Gain，F/G)。

1.4.4 免疫器官指数和肠道菌群数量的测定 分别从各组中选取8只体况相近的21和35 日龄鸭，颈静脉放血处死，立即解剖分离胸腺、脾脏和法氏囊，称体质量，计算免疫器官指数，计算公式为：免疫器官指数=免疫器官质量(g)/体质量(kg)；同时取盲肠内容物，按照文献[22]方法测定大肠杆菌、乳酸杆菌的数量，结果以每克肠道内容物中细菌个数(CFU/g)的常用对数表示。

1.5 数据处理

采用 SPSS v19.0 对试验数据进行处理和统计分析，进行F检验，并用Duncan’s法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 复合益生菌生物消毒剂的制备

经检测在制备的单一益生菌制剂浓缩液中，枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、酵母菌的活菌数分别为5.11×1011，2.98×1011和1.13×1011CFU/mL。根据单一益生菌制剂的最佳抑菌浓度(108CFU/mL)及正交试验结果(表2)，确定复合益生菌生物消毒剂中枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、酵母菌3种菌液的最优用量依次为5.0×108，3.0×108和2.0×108CFU/mL，据此比例复配复合益生菌生物消毒剂，为保证消毒效果，按照文献[20]以2倍最佳抑菌浓度作为消毒剂实际使用浓度。

2.2 复合益生菌生物消毒剂喷雾消毒周期的确定

采用复合益生菌生物消毒剂对常规鸭舍喷雾消毒，经统计分析，4～22日龄鸭舍消毒后72 h鸭舍环境活菌数为18.83×103～19.78×103CFU/m3，消毒后96 h环境活菌数为26.48×103～27.31×103CFU/m3；23～39日龄鸭舍消毒后48 h环境活菌数为22.44×103～22.72×103CFU/m3，72 h环境活菌数为29.71×103～31.94×103CFU/m3。根据《畜禽场环境质量标准》(NY/T 388-1999)中规定的禽舍环境细菌数不超过25 000 CFU/m3的要求，确定复合益生菌生物消毒剂对4～22日龄鸭舍的消毒周期为3 d消毒1次，对23～39日龄鸭舍的消毒周期为2 d消毒1次。

2.3 复合益生菌生物消毒剂对鸭舍环境空气质量的影响

复合益生菌生物消毒剂对鸭舍环境空气质量的影响结果见表3。

注：同一指标同列数据标不同小写字母表示差异显著(P<0.05 )。下表同。

Note:Different lowercase letters in each column for same index represent significant difference (P<0.05).The same below.

由表3可以看出，随着肉鸭日龄的增大，各组鸭舍内NH3、H2S、CO2含量与活菌数均呈现出逐渐升高的趋势。对照组鸭舍NH3、H2S含量与活菌数在试验周期内均显著高于试验1组和试验2组(P<0.05)， CO2含量自第3周起显著高于试验1组(P<0.05)，而与试验2组没有显著差异(P>0.05)。2个试验组间相比，自第3周起试验1组鸭舍NH3含量与活菌数均显著高于试验2组(P<0.05)，而CO2含量则显著低于试验2组(P<0.05)；2个试验组间的H2S含量差异不显著(P>0.05)。从平均值来看，试验2组鸭舍NH3含量与活菌数分别比试验1组下降42.21%和24.65%(P<0.05)，H2S含量下降12.27%(P>0.05)。说明复合益生菌生物消毒剂较苯扎溴铵能更好地降低鸭舍中NH3含量与活菌数，但对H2S含量的降低无显著作用。

2.4 复合益生菌生物消毒剂对肉鸭生产性能的影响

复合益生菌生物消毒剂对肉鸭生产性能的影响见表4。

由表4可以看出，各组肉鸭日增质量呈现先增加后下降的趋势，日采食量、料肉比则一直呈现增加趋势。自第2周起，试验2组的日增质量、料肉比显著优于对照组和试验1组(P<0.05)；2个试验组间日采食量没有显著差异(P>0.05)；对照组肉鸭在第3、4和5周出现发病，且呈现上升趋势，2个试验组肉鸭没有出现发病情况。整个试验期间，与对照组相比，试验1、2组肉鸭日增质量分别提高6.84%和16.01%(P<0.05)，日采食量分别提高6.12%和9.39%(P<0.05)；试验2组日增质量较试验1组提高8.58%(P<0.05)；料肉比较试验1组降低5.36%(P<0.05)。说明与苯扎溴铵相比，复合益生菌生物消毒剂可以显著提高肉鸭日增质量，降低料肉比。

2.5 复合益生菌生物消毒剂对肉鸭免疫器官指数的影响

复合益生菌生物消毒剂对肉鸭免疫器官指标的影响见表5。由表5可以看出，21日龄时，试验2组法氏囊指数、胸腺指数显著高于对照组和试验1组(P<0.05)，分别提高了31.06%，26.28%和 24.42%，19.80%；35日龄时，试验2组脾脏指数、胸腺指数显著高于对照组和试验1组(P<0.05)，分别提高了45.00%，35.94%和22.99%，15.41%。整个试验期内，试验1组各指标与对照组间无显著差异(P>0.05)。说明复合益生菌生物消毒剂有助于促进肉鸭免疫器官的发育。

2.6 复合益生菌生物消毒剂对肉鸭盲肠菌群的影响

复合益生菌生物消毒剂对肉鸭盲肠菌群数量的影响见表6。由表6可以看出，试验1组、2组肉鸭盲肠大肠杆菌数量均显著低于对照组(P<0.05)，乳酸杆菌数量均显著高于对照组(P<0.05)。21日龄时，试验2组大肠杆菌数量较试验1组降低了9.79%(P<0.05)；35日龄时，试验2组乳酸杆菌数量较试验1组提高了7.96%(P<0.05)，大肠杆菌数量则降低了5.49%(P<0.05)。说明复合益生菌生物消毒剂可以促进肉鸭盲肠乳酸杆菌的繁殖，抑制大肠杆菌的生长。

注：表中数据为细菌数量(CFU/g)的常用对数。

Note:The data are common logarithm of bacterial number(CFU/g).

3 讨 论

3.1 复合益生菌生物消毒剂对鸭舍环境空气质量的影响

环境中微生物数量与有害气体含量是评价鸭舍环境质量的重要指标。鸭舍空气中的细菌主要包括致病菌、条件致病菌和非病原菌；鸭舍内的有害气体主要包括NH3、H2S和CO2，其中NH3主要来自未被消化的饲粮氮和内源氮，H2S主要由含硫有机物经微生物分解产生，CO2主要是鸭及舍内微生物的呼吸作用产生的。因此消毒是控制环境微生物的有效手段，提高饲料转化率是降低鸭舍有害气体的有效途径。目前，常用化学消毒剂的作用机理是改变微生物赖以生存的环境，致使微生物的内外结构发生改变，主要代谢机能出现障碍，从而使生长发育受阻达到杀菌目的，其在杀灭有害微生物的同时也会杀灭有益微生物，并伴有微生物抗药性的产生[23]。本研究以枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、酵母菌3株益生菌制备的复合益生菌生物消毒剂，一方面利用了3种益生菌及其代谢产物对致病菌和条件致病菌的拮抗作用，达到生物消毒的目的；另一方面利用益生菌的特殊代谢物，如芽孢杆菌能够产生氨基氧化酶和硫化氢氧化酶，将吲哚类氧化成无毒无害物质[17]，使硫化氢氧化脱氢转化成单质硫[24]，从而降低鸭舍内的NH3、H2S含量。此外，通过其复配协同作用可促进有益菌生长，提高饲料转化率。本研究结果表明，与苯扎溴铵相比，复合益生菌生物消毒剂使鸭舍活菌数、NH3含量分别下降42.21%(P<0.05)和24.65%(P<0.05)，H2S含量下降12.27%(P>0.05)。该结果与陈静等[17]报道的微生态喷雾剂(由放线菌、乳酸菌、芽孢杆菌等组成)较化学消毒剂聚维酮碘能显著降低鸡舍中H2S含量的研究结果存在差异，可能原因是所选菌株及其代谢物的特异性不同，其降低鸭舍内有害气体机制作用不同，这有待进一步深入研究。

3.2 复合益生菌生物消毒剂对肉鸭生产性能的影响

有研究报道，饲喂复合益生菌制剂可以显著提高畜禽生产性能[12-13,19]。本研究通过喷雾消毒方式，考查制备的复合益生菌生物消毒剂对肉鸭生产性能的影响，研究表明，与苯扎溴铵相比，复合益生菌生物消毒剂可以使肉鸭平均日增质量显著提高8.58%(P<0.05)，料肉比显著降低5.36%(P<0.05)。说明复合益生菌生物消毒剂在生物消毒的同时，有利于肉鸭生产性能的提高。究其原因在于，肉鸭不仅可以摄取消毒时喷洒在饲料、饮水中的益生菌，而且喷雾的益生菌制剂可以通过呼吸作用直接进入肉鸭呼吸道，抑制呼吸道内有害微生物生长，从而促进生产性能的提高。

3.3 复合益生菌生物消毒剂对肉鸭免疫器官指数与肠道菌群的影响

免疫器官指数是衡量机体免疫力高低的指标，其绝对质量和相对质量越大，说明机体的细胞免疫和体液免疫机能越强。本研究结果表明，复合益生菌生物消毒剂不仅可以促进肉鸭法氏囊、脾脏、胸腺免疫器官的生长发育，而且可以提高肠道乳酸杆菌的数量，降低大肠杆菌数量，其原因是复合益生菌生物消毒剂中的枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、酵母菌在发酵过程中合成维生素、氨基酸、有机酸、醇类等物质，直接促进免疫器官的生长发育，同时有益菌株作为良好的免疫激活剂又可协同促进动物免疫器官的生长和发育[25]；另一方面，枯草芽孢杆菌通过生物夺氧作用抑制有害菌的生长，使肠道内pH值下降，从而促进了肠道内乳酸杆菌的增殖与发育，而乳酸杆菌又可通过产生有机酸抑制有害菌的生长，通过复合益生菌的协同效应，维持了肠道微生态平衡。

4 结 论

复合益生菌生物消毒剂不仅能显著降低鸭舍内NH3含量与活菌数(P<0.05)，而且可以显著提高肉鸭平均日增质量、降低料肉比(P<0.05)，对抑制肉鸭盲肠大肠杆菌的生长，促进乳酸杆菌的增殖也有显著效果。

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XI Lei1a,WANG Yong-fen1b,SHI Zhi-fang1a,FAN Jia-ying1a,ZHAO Fu-rong2

(1 aDepartmentofAnimalHusbandryandEngineering,bDepartmentofBio-engineering,HenanUniversityofAnimalHusbandryandEconomy,Zhengzhou,Henan450011,China;2CollegeofAnimalScience&Technology,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang,Henan471003,China)

【Objective】 The research prepared biological disinfectant using composite probiotics and studied its effects on shed environment,production performance and health condition of duck.【Method】 In this research,Bacillussubtilis,Lactobacillusand microzyme were chosen to prepare composite biological disinfectant based on the optimum mixing ratio obtained through orthogonal experiment with 3 factors and 4 levels.The spray disinfectant period was also determined.Then,600 ducks at the age of 4 days were divided into control group,benzalkonium bromide disinfection group (test 1) and composite probiotics biological disinfection group (test 2) randomly and number of live bacteria and harmful gas concentration in environment,production performance,immune function and intestinal micro flora of treated ducks were compared.【Result】 Compared with benzalkonium bromide disinfection group,concentration of ammonia and number of live bacteria in composite probiotics group decreased by 42.21% and 24.65% (P<0.05),average daily gain increased by 8.58% (P<0.05),feed meat ratio reduced by 5.36% (P<0.05),spleen index and thymus index increased by 35.94% and 15.41% (P<0.05),number of cecalLactobacillusincreased by 7.96% (P<0.05),and theEscherichiacolinumber decreased by 5.49% (P<0.05). 【Conclusion】 Composite probiotics biological disinfectant improved shed environment,production performance and immune function of duck.

composite probiotics biological;bio-disinfectant;duck shed environment;production performance;immune function

2014-11-27

河南省重点科技攻关项目“规模养鸭场污染控制关键技术研究与应用”(122102110053)

席 磊(1971-)，男，河南商丘人，副教授，博士，主要从事畜禽健康养殖与环境控制技术研究。 E-mail:xileihn@163.com

时间:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.030

S815.5

A

1671-9387(2015)07-0041-08

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150610.0840.030.html