杏鲍菇采后木质化相关基因实时定量PCR中内参基因的选择

秦晓艺，王 杰

(华南农业大学 食品学院，广东 广州 510642 )

杏鲍菇采后木质化相关基因实时定量PCR中内参基因的选择

秦晓艺，王 杰

(华南农业大学 食品学院，广东 广州 510642 )

【目的】 筛选出合适的内参基因，为分析不同贮藏时期杏鲍菇(Pleurotuseryngii)子实体中木质化相关基因的表达提供支持。【方法】 以4 ℃低温贮藏0，3，6，9，12，15和18 d的杏鲍菇子实体为材料，采用实时荧光定量 PCR(Quantitative real-time PCR，RT-qPCR)技术，分析了β-actin、18SrRNA、β-tubulin、ELF和GAPDH5个候选内参基因在不同贮藏时期杏鲍菇的表达情况；通过GeNorm和NormFinder 2种软件筛选出最稳定的内参基因；选取最佳内参基因，采用相对表达定量法对木质素合成途径中的关键酶，即苯丙氨酸转氨酶(Phenylalanina ammonia-lyse，PAL)基因的表达进行定量分析。【结果】 5个内参基因均能特异扩增， 其中GAPDH基因表达丰度较低，不适合用作内参基因；经GeNorm 软件分析计算，β-actin、β-tubulin、ELF、18SrRNA表达稳定度平均值M分别为0.527，0.527，0.584，0.875，最适内参基因组合为β-actin、β-tubulin和ELF；由NormFinder 软件分析计算，β-actin、β-tubulin、ELF、18SrRNA稳定值S分别为0.221，0.356，0.583，1.092，β-actin稳定性最高；综合分析认为β-actin的表达稳定性最高，为最佳内参基因；以β-actin为内参基因，发现4 ℃低温贮藏3，6，9，12，15和18 d的杏鲍菇子实体中PAL基因表达量分别比新鲜样品(0 d)增加了11.3%，10.8%，11.3%，11.5%，11.4%，10.7%。【结论】β-actin可作为杏鲍菇子实体采后贮藏条件下品质变化相关基因表达研究的内参基因。

杏鲍菇；采后木质化；内参基因；实时定量PCR

杏鲍菇(Pleurotuseryngii)又名刺芹侧耳，隶属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、无隔担子菌亚纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属，是近年来开发栽培成功的集食用、药用、食疗于一体的珍稀食用菌新品种[1]。随着杏鲍菇栽培和供应量的大幅增加，如何在采后贮藏中保持鲜菇的品质已成为杏鲍菇产业发展中亟待解决的问题。本课题组在前期研究发现，采后贮藏条件下的杏鲍菇容易发生由木质化引起的质地劣变。发生木质化劣变的杏鲍菇子实体中木质素的含量显著增加，硬度上升，韧性增强，严重影响其质地和口感，降低其食用价值和商品价值。木质化的发生与植物组织细胞壁中木质素的沉积有关，而木质素的生成由一系列酶来调控[2]。因此，研究不同贮藏时期杏鲍菇中与木质素合成关键酶基因的表达情况对阐明木质化发生的分子机制尤为重要。

在现有的基因表达分析方法中，实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术具有灵敏性高、特异性强、快速准确等特点[3-4]，已成为基因表达定量分析的首选方法，广泛应用于生物体内基因功能的研究[5-6]。然而，在基因表达分析中，有很多可变参数需要加以控制，如起始RNA的质量和数量、反转录合成效率及扩增效率等，这些因素都有可能导致RT-qPCR分析结果产生差异[7]。因此，需要引入合适的内参基因对样品进行归一化处理，然后再对目的基因的表达量进行分析。理想的内参基因应在不同试验条件下和不同细胞或组织中均能够恒定表达。实际研究中通常选用持家基因作为内参基因，如α微管蛋白和β微管蛋白基因(α-tubulin、β-tubulin)、β肌动蛋白基因(β-actin)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)、延伸因子1(ELF)、多聚泛素酶基因(UBQ)以及18S核糖体RNA基因(18SrRNA)等[8]。但任何一种持家基因的稳定表达都是在一定条件下相对稳定，因此在应用RT-qPCR分析基因表达的研究时，必须根据不同样品和不同的试验条件，选择出相对合适的内参基因及其数目，进行数据的校正和标准化，才能对目的基因表达进行准确可靠的定量[9]。目前，内参基因的筛选在灵芝(Ganodermalucidum)[10-11]、糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)和肺形侧耳(Pleurotuspulmonarius)[12]、白灵侧耳(Pleurotuseryngiivar.tuoliensisC.J. Mou)[13]、草菇(Volvariellavolvacea)[14-15]等食用菌上已有一些报道，但多是采用半定量RT-PCR技术分析食用菌液体培养或生长发育过程中候选内参基因或目的基因的转录特征，尚未见与食用菌采后贮藏品质变化相关内参基因的研究报道。为此，本研究以不同贮藏时期的杏鲍菇子实体为材料，选择β-actin、18SrRNA、β-tubulin、ELF和GAPDH5个常用的持家基因，采用RT-qPCR技术，结合GeNorm[7]和 NormFinder[16]分析软件对5个候选基因在不同贮藏时期杏鲍菇中的表达稳定性进行评价，筛选出表达最稳定的内参基因，并分析本课题组克隆的木质素合成途径中的关键酶基因PAL(GenBank：KF938514)在不同贮藏期的相对表达模式，以期为后续杏鲍菇采后木质化衰败相关基因的表达研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验所用杏鲍菇采于广东蓝田农业有限公司。选取大小均匀、品质良好的杏鲍菇用保鲜袋包装不密封，贮藏温度为4 ℃，相对湿度为98%。每隔3 d取1次样，取样位置均为距离菌盖1 cm处。取样后立即用液氮速冻，于-80 ℃保存。

1.2 总RNA提取与反转录

分别取 100 mg贮藏0，3，6，9，12，15，18 d的杏鲍菇子实体组织样品，在无菌研钵中用液氮研磨成粉末，按照 E.Z.N.A.TMFungal RNA Kit(Omega公司)试剂盒说明书提取总 RNA，采用1%非变性琼脂糖凝胶电泳(6 V/cm，恒压)检测其完整性，并用NanoDrop核酸浓度测定仪测定其浓度，根据A260 nm/A280 nm和A260 nm/A230 nm确定 RNA 的纯度。反转录合成第一链 cDNA时，按照PrimeScriptTMRT-PCR Kit(TaKaRa 公司)试剂盒的操作说明，在10 μL的反应体系中依次加入dNTP Mixture(10 mmol/L) 1 μL，Oligo dT Primer(2.5 μmol/L) 1 μL，Total RNA(1 000 ng/μL) 1 μL，RNase Free dH2O 7 μL，瞬时离心混匀，65 ℃变性退火5 min，冰浴条件下再在上述反应液中加入5×PrimeScript®Buffer 4 μL，RNase Inhibitor(40 U/μL) 0.5 μL，PrimeScript®RTase(for 2 step)0.5 μL，RNase Free dH2O 5 μL，30 ℃反应10 min，42 ℃反应30 min，95 ℃反应5 min使酶失活，所得产物即为初始cDNA，于-20 ℃冰箱保存备用，用于后续标准曲线和基因表达稳定性的分析。

1.3 引物设计及qPCR

根据相关研究文献[10-11,15]，选取了5个候选内参基因，包括β-肌动蛋白基因(β-actin)、18S核糖体RNA基因(18SrRNA)、β-微管蛋白基因(β-tubulin)、延伸因子 1(ELF)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)。根据NCBI中已公布的杏鲍菇及与其同源性较高的序列，用 Primer Premier 5.0 软件设计5个内参基因以及PAL基因特异性引物序列(表1)，并验证引物二聚体、发卡结构等。引物合成和扩增产物的基因序列测定均由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

RT-qPCR 反应体系为 20 μL：荧光染料iQTMSYBR®Green Supermix (2×)10 μL ，双蒸水7.2 μL，10 μmol/L的上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL，混匀。反应在荧光定量PCR管(TLS-0851， BIO-RAD公司)和CFX96 Connect实时荧光定量PCR 仪(BIO-RAD公司)上进行，经摸索和优化，最终确定的实时荧光定量 PCR反应条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性 10 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸15 s，50 个循环；最后在 65～95 ℃监测熔解曲线过程，每 0.5 ℃进行 1 次荧光监测。经熔解曲线分析确认所设计的引物无非特异扩增及引物二聚体后，将cDNA 模板按 1∶5 梯度稀释成 5 个浓度梯度进行标准曲线分析，并计算不同引物的扩增效率。每个处理进行 3 次重复，对照用已经处理过的灭菌水代替模板。数据读取由实时荧光定量PCR仪自动完成。

1.4 数据处理与分析

依据公式Q=EΔCt，应用 Excel 2003软件，计算每个扩增样品的Ct值所对应的相对表达量Q值。其中E为基因扩增效率(一般情况下将基因扩增设为理想扩增，E值默认为2)，ΔCt=Ctmin-Ct样品(Ctmin为全部样品中最低Ct值，Ct样品为各样品的Ct值)[17]。

将相对定量数据导入 GeNorm软件(http://medgen.ugentbe/～jvdesomp/genorm)，分析得到不同贮藏期杏鲍菇中各内参基因的表达稳定度平均值(M)并进行排序(M值越低，基因表达越稳定)。此外，用GeNorm软件分析内参基因标准化因子的配对变异值Vn/(n+1)值，以 0.15 为默认取舍值[18]，确定所需内参基因的最适数目(即当Vn/(n+1)大于0.15，则有必要引入第n+1个基因作为RT-qPCR 定量分析的内参基因，反之，则不必使用 ≥n+1 个基因作为内参基因)[19]。将数据导入NormFinder软件(http://www.mdl.dk/publicationsnorm finder.htm)，分析得到不同贮藏期杏鲍菇中各内参基因的表达稳定值(S)并得出最稳定的基因(S值越小，基因表达越稳定)[20]。综合2种软件分析结果，确定不同贮藏期杏鲍菇中最稳定的内参基因。选取最佳内参基因，采用相对表达定量法(2-ΔΔCt法)对目的基因PAL在不同贮藏期杏鲍菇中的基因表达进行定量分析，其中，ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct内参基因)处理组-(Ct目的基因-Ct内参基因)对照组[21]。

2 结果与分析

2.1 杏鲍菇子实体总 RNA 的提取及品质检测

不同贮藏期杏鲍菇子实体总RNA的电泳结果见图1。

图1结果显示28S rRNA、18S rRNA 和 5S rRNA 3 条带，其中 28S rRNA和 18S rRNA 条带明亮，5S rRNA 条带较暗淡，说明RNA 完整性较好。测定其浓度时，A260 nm/A280 nm为1.8～2.2，A260 nm/A230 nm为2.0～2.4，说明所测定贮藏0，3，6，9，12，15，18 d的7种杏鲍菇的RNA纯度和质量均较好。综上所述，提取的杏鲍菇子实体总 RNA可以用于后续标准曲线和基因表达稳定性的分析

2.2 杏鲍菇5个候选内参基因的qPCR标准曲线

对5个候选内参基因的熔解曲线进行分析，结果(图2)发现其熔解曲线均为单峰，反应过程中无非特异性扩增和引物二聚体，说明这5个基因引物特异性良好。将7个不同贮藏期杏鲍菇cDNA 模板按 1∶5 梯度分别稀释成相同倍数的浓度梯度，以Ct值为纵坐标，相对拷贝数的对数为横坐标进行相应的标准曲线分析，结果(表2)表明，除GAPDH外其他基因的扩增效率为 99.4%～105.0%，决定系数为 0.999～1.000。非变性琼脂糖凝胶电泳结果(图3)表明，5个候选内参基因的扩增片段条带整齐，无可见引物二聚体。

经熔解曲线和标准曲线的共同分析，除GAPDH外，所设计的 4 个内参基因引物均符合 RT-qPCR 试验要求。而GAPDH经普通PCR扩增后在110 bp左右有1条单一较亮的带，说明引物特异性良好，但在RT-qPCR中直到33个循环后才起峰，扩增效率低，分析其原因可能是GAPDH为糖酵解、糖异生和卡尔文循环过程中的关键酶[22]，GAPDH主要是在物质合成时表达较高，而在贮藏阶段主要以降解为主，基因表达丰度较低，不适合用作内参基因。

2.3 杏鲍菇4个候选内参基因的Ct值稳定性评价

以不同贮藏期的杏鲍菇cDNA为模板进行RT-qPCR，得Ct值如图4所示。从图4可以看出， 不同贮藏期的杏鲍菇在扩增同一基因，或同一贮藏期的杏鲍菇在扩增4种不同基因时，Ct值均有明显差异，其原因主要是不同组织同一基因以及同一组织不同基因的表达强度均有所不同。用Excel 2003对所得数据进行统计分析，结果显示同一扩增反应的3个重复的标准差很小，Ct值非常接近，说明扩增反应重复性好，能准确反映基因的转录水平。

2.4 杏鲍菇4个候选内参基因的稳定性评价

经GeNorm 软件分析计算，结果见图5。从图5可以看出，β-actin、β-tubulin、ELF、18SrRNA表达稳定度平均值M由低到高分别为0.527，0.527，0.584，0.875。由此可见，稳定性最好的内参基因是β-actin和β-tubulin，而ELF和18SrRNA稳定性较差。分析内参基因标准化因子的配对变异值Vn/(n+1)，结果(图6)表明：Vn/(n+1)均大于 0.15，其中V2/3=0.185>0.15，所以若选用多个内参基因校正杏鲍菇不同贮藏期 mRNA 的表达水平，理想的内参基因数目为 3个，由此建议选用β-actin、β-tubulin和ELF组合。

用NormFinder 软件分析内参基因的原理是根据基因表达稳定值S的大小衡量，与GeNorm 软件分析类似，稳定值S越小，其内参基因的表达稳定性越大，但该软件不能预测内参基因组合的数目。 NormFinder软件分析结果(图7)显示，在杏鲍菇7个不同贮藏期，4 个内参基因的表达稳定值S为β-actin(0.221)<β-tubulin(0.356)

由于软件间的算法和判断标准不同，不同软件得出同一内参基因的表达稳定性不一致，因此评估内参基因时宜综合分析后进行排序比较[23]。由GeNorm软件分析得出表达最稳定的内参基因是β-actin、β-tubulin和ELF，最合适的内参基因数目为3个；通过NormFinder软件评价得到的最稳定内参基因为β-actin，所以结合2种软件分析结果确定选用β-actin作为内参基因,用于校正实时荧光定量分析中目的基因PAL的表达。

2.5 杏鲍菇中PAL相对表达模式

苯丙氨酸转氨酶(PAL)是连接初级代谢和苯丙烷类代谢、催化苯丙烷类代谢第一步反应的酶，是木质素和多酚类物质合成途径的关键酶[2]。根据杏鲍菇内参基因稳定性评价结果，以β-actin作为内参基因，采用相对表达定量法(2-ΔΔCt法)，检测杏鲍菇不同贮藏时间(3，6，9，12，15 和18 d)PAL基因相对于新鲜样品(0 d)基因表达量(默认为 1)的变化，结果如图8 所示。由图8可以看出，与新鲜样品相比，PAL在贮藏期间(3，6，9，12，15 和18 d)的相对表达量均显著增加(P<0.05)。其中在0～3 d的相对表达量升高到1.11，3～6 d又有所降低，之后又开始上升，至12 d升至最高值1.12，12～18 d又有一定幅度的下降，贮藏终点时相对表达量为1.11，其变化趋势与试验中测得的木质素含量的变化趋势相似。此外，低温贮藏期间杏鲍菇中多酚含量也显著高于新鲜样品，这可能是PAL基因表达量在贮藏期间一直处于较高水平的原因之一。

图7 候选内参基因在不同贮藏期杏鲍菇中表达稳定值的NormFinder分析
Fig.7 Stability values of candidate reference genes ofPleurotuseryngiiat different storage periods analyzed by NormFinder

图8 不同贮藏期杏鲍菇中PAL基因相对表达量的比较
Fig.8 Relative expression levels ofPALinPleurotuseryngiiat different storage periods

3 结论与讨论

实时荧光定量PCR是分析基因表达的一种有效方法，选用一种合适的内参基因对目的基因的表达量进行校正可以提高该方法的灵敏度和重复性[6]，因此在基因相对表达研究中选择合适的内参基因十分关键。可用于评价内参基因稳定性的方法较多，如qBasePlus软件[24]、REST软件[25]、BestKeeper软件[26]等。由于稳定的内参基因并不多，多数内参基因在不同的组织、细胞及不同条件下的转录量并不恒定，甚至差别很大[27]，因此为了保证定量 PCR 结果的准确性，内参基因转录水平的稳定性非常重要。本试验采用RT-qPCR技术，并结合GeNorm 、NormFinder 2种软件，对β-actin、ELF、β-tubulin、18SrRNA和GAPDH5个常用内参基因在不同贮藏期杏鲍菇中的表达稳定性进行综合评估，筛选出最佳内参基因，用于木质素合成关键酶基因——PAL相对表达模式的分析。

本试验选用GeNorm 、NormFinder 2种软件对经杏鲍菇qPCR分析后的β-actin、ELF、β-tubulin和18SrRNA4 种候选内参基因在不同贮藏时期的表达稳定性进行综合评价，结果发现，18SrRNA、β-tubulin和ELF在杏鲍菇不同贮藏期的表达稳定性均较差，不适合作为内参基因，而β-actin表达最稳定，为理想的内参基因。本研究中选用β-actin作为内参基因，建立了一种杏鲍菇不同贮藏时期基因相对表达量的研究体系，通过木质素合成关键酶基因PAL的 RT-qPCR 分析，发现PAL在贮藏期间(3，6，9，12，15，18 d)表达显著上调，说明PAL可能在采后杏鲍菇木质素合成过程中发挥着重要作用。

Jain等[28]通过对水稻(Oryzasativa)中10个常用内参基因的考察，发现eEF-1α在不同组织中的表达较一致，18SrRNA在不同环境处理下表达较稳定；李冉等[29]发现，水稻经机械损伤处理、二化螟处理、稻纵卷叶螟处理后最稳定的内参基因依次为eEF-1α、25SrRNA和Actin；蒋晓梅等[30]以柳枝稷根组织为材料，同样发现在不同的非生物环境胁迫条件下，最适合的内参基因各不相同；Reid等[31]发现，在葡萄浆果发育期间GAPDH表达水平总是保持一致，Gu等[32]在高温胁迫处理下的菊花中也得到相似的结论。孙美莲等[33]利用荧光定量PCR分析茶树不同器官组织中的基因表达差异时，发现α-tubulin和18SrRNA的稳定性都不如β-actin，而比较不同成熟度的叶片和愈伤组织时，GAPDH比18SrRNA和β-actin表达更稳定。侯志强等[34]对不同胁迫条件下鲜切马铃薯中 4 个常用内参基因的表达分析表明，β-actin基因表达相对稳定，EF1α最不稳定。由此可见，在实际研究中内参基因只是细胞处于特定条件下的相对稳定表达[35]。

本研究结果表明，传统内参基因β-actin在不同贮藏时期杏鲍菇组织中的表达相对稳定，而18SrRNA、ELF、β-tubulin和GAPDH4种候选基因表达则不稳定。同时，应用GeNorm、NormFinder 2种软件筛选出低温贮藏杏鲍菇最合适的内参基因，对后续研究杏鲍菇木质化相关酶基因以及其他未知功能基因与木质化的联系具有重要意义。

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Selection of reference gene for quantitative real-time PCR analysis of lignification related genes in postharvestPleurotuseryngii

QIN Xiao-yi,WANG Jie

(CollegeofFoodScience,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,Guangdong510642,China)

【Objective】 The objective of this experiment was to select suitable reference gene to support analysis of the expression of lignification related genes inPleurotuseryngiiat different storage periods.【Method】 In this study,quantitative real-time PCR (RT-qPCR) was used to analyze the mRNA expression of five candidate reference genes,β-actin,18SrRNA,β-tubulin,ELFandGAPDH,inPleurotuseryngiistored at 4 ℃ for different periods (0,3,6,9,12,15 and 18 d).The most stable genes were selected by GeNorm and NormFinder.Then,with the relative quantification method,the expression of Phenylalanina ammonia-lyse (PAL),a key enzyme in lignin biosynthesis pathway,was valuated.【Result】 All of the five reference genes could amplify specially.GAPDHwas unsuitable because of its less abundant expression.Mean stabilities ofβ-actin,β-tubulin,ELF,and 18SrRNAwere 0.527,0.527,0.584,and 0.875,analyzed by GeNorm,respectively.The optimum reference genes were a combination ofβ-actin,β-tubulinandELF.Stability values ofβ-actin,β-tubulin,ELF,and 18SrRNAanalyzed by NormFinder were 0.221,0.356,0.583,and 1.092,andβ-actinwas the most stable one.Comprehensive analysis showed thatβ-actinwith the highest stability was the most suitable gene.Then usingβ-actinas the reference gene,relative changes ofPALexpression inPleurotuseryngiiat different storage periods (3,6,9,12,15 and 18 d) increased significantly (11.3%,10.8%,11.3%,11.5%,11.4%,and 10.7%,respectively) compared to fresh sample (0 d).【Conclusion】β-actinwas the most suitable reference gene to normalize mRNA levels of quality related genes inPleurotuseryngii.

Pleurotuseryngii;postharvest lignification;reference gene;quantitative real-time PCR

2014-04-18

国家自然科学基金项目(31101589)；广东省科技计划项目(2011B020310006)

秦晓艺(1990-)，女，河南三门峡人，硕士，主要从事食用菌生理生化及分子生物学研究。 E-mail：qinxiaoyi0503@163.com

王 杰(1978-)，女，河南驻马店人，副教授，博士，硕士生导师，主要从事食药用真菌生物工程研究。 E-mail：wjcasey@scau.edu.cn

时间:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.024

Q789;S646

A

1671-9387(2015)07-0219-09

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150610.0840.024.html