复制慢性高原病动物模型实验教学中注意事项分析

李晓栩，黄 瑊，杨诚忠，谭小玲，蔡明春，崔中来，官立彬

（第三军医大学高原军事医学系高原生理学与高原生物学教研室/教育部高原医学重点实验室和全军高原医学重点实验室，重庆400038）

复制慢性高原病动物模型实验教学中注意事项分析

李晓栩，黄 瑊，杨诚忠，谭小玲，蔡明春，崔中来，官立彬

（第三军医大学高原军事医学系高原生理学与高原生物学教研室/教育部高原医学重点实验室和全军高原医学重点实验室，重庆400038）

该文主要介绍实验教学中高原红细胞增多症合并高原心脏病动物模型复制的方法和注意事项，通过模型的复制，以及对存在的具体问题和注意事项的逐步剖析，使学生全面了解实验方法和取材方法，在实验前熟悉低压舱使用、动物饲养及动物取材注意事项，为学生提供一个标准化的模型复制程序，使复制高原红细胞增多症合并高原心脏病的动物模型更加稳定，降低动物的死亡率，提高模型复制的成功率，确保模型复制过程中进舱人员的安全。

高海拔； 高原病； 模型，动物； 大鼠； 实验教学

慢性高原病（chronicmountain sickness，CMS），国际上习惯称为慢性高山病，是高原地区危害人体健康的常见慢性病，分为高原红细胞增多症、高原心脏病、高原血压异常、高原衰退症，国际上统一应用青海标准作为其诊断标准[1-3]。CMS主要发生在长期生活工作在海拔3 000m以上的人群，其发病机制与高原低氧有直接关系[4-5]。高原红细胞增多症合并高原心脏病动物模型是研究CMS的一种常用的实验模型，但目前动物选择、模型复制方法（缺氧方法、缺氧时间和海拔高度）尚不统一，而且实验中的取材方法对实验结果的影响报道甚少，而选择合适的实验动物和模型复制方法是教学科研成功的关键。

在实验教学中，教师通常采用低压低氧动物实验舱模拟海拔5 000m复制大鼠高原红细胞增多症合并高原心脏病模型。本文通过对实验过程和多次的大鼠解剖观察，模型制备过程的关键环节的分析，总结出一套实验准备，模型复制和取材的注意事项。希望学生在教学实践过程中通过对各环节影响因素的了解，达到提高模型复制的成功率，降低动物模型复制中的死亡率，顺利完成实践教学的目的，为以后进行规范化的教学科研奠定基础。

1 教学内容

1.1 仪器与试剂 10%乌拉坦，肝素，生理盐水，红细胞稀释液，血红蛋白测定试剂盒，蒸馏水，显微镜，动脉导管，静脉导管和大鼠鼠台。

1.2 实验方法 将SD大鼠分为平原组和缺氧组，缺氧大鼠组置于低压舱内，以200m/min速度上升至模拟海拔5 000m，进行连续缺氧28 d，每48小时进入过渡舱为大鼠添加食物、水及打扫卫生，平原组大鼠放于另一低压舱内，在平原环境下饲养28 d。

1.3 动物取材 缺氧28 d后，进行取材。缺氧组在模拟海拔4 000m下进行取材，平原组则在平原环境下进行。首先，使用10%乌拉坦，1mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，自大鼠右侧颈外静脉插入聚乙烯塑料微导管，导管另一侧连接压力传感器，用多导生理记录仪记录平均肺动脉压（mPAP）及右心室压力（RVP）、与右心室内压变化速率等，待记录完毕后，抽取大鼠动脉血测定血气，对红细胞进行计数，再加入1mL全血置于血球比积管中，3 000 r/min离心15min，测量血球压积，根据血红蛋白测定试剂盒说明书测定血红蛋白，采血后快速打开胸腔取出大鼠心脏，去掉心房，沿室间隔边缘小心分离右心室（RV）和左心室（LV）+室间隔（S），用生理盐水漂洗2~3遍后，用滤纸吸干水分后称量RV和LV+S的质量，以RV/（LV+S）和RV/BW（体质量）反映RV肥厚程度。

2 注意事项

2.1 低压舱使用注意事项

2.1.1 确保进仓人员的安全 进入低压舱的学生必需身体健康，患有严重的心血管疾病、呼吸系统疾病或感冒者勿入。进入低压舱前，学生必须熟悉低压舱的使用规则，了解舱内设施情况，如通讯设施、递物舱、吸氧设备的位置，并由专业人员对通讯，递物舱，吸氧设备的使用方法进行培训。在低压舱模拟开始时再次检查吸氧设备的工作情况。另外，为了确保学生在舱内的安全，禁止单人进入。由于在上升过程中外界压力迅速降低，而中耳内压力高，容易导致中耳胀气，引起耳部不适，因此学生在上升过程中应进行适当咀嚼活动，而在下降过程中，外界压力迅速增高，而中耳内压力低，容易导致耳膜压痛，甚至穿孔，因此学生在下降过程中应进行咽鼓管充气。若发生高原反应，如心率过快、头痛剧烈、耳鸣等不适症状，应迅速吸氧并联系舱外工作人员，降至平原。

2.1.2 动物饮水瓶灌装的注意事项 低压舱在上升过程中，由于外界压力变化，会导致动物饮水瓶中的水不断滴入动物笼中，如果滴水过多，动物笼中则会过于潮湿，会导致病原微生物和寄生虫的过度繁殖，垫料和饲料易发生霉变，不利于大鼠的健康，易造成大鼠的死亡。因此，在进行减压前，应该完全灌满全部饮水瓶，减少滴水的发生。

2.2 动物饲养注意事项

2.2.1 实验动物 高原红细胞增多症合并高原心脏病模型复制常选用健康成年SD大鼠，清洁型，体质量180~ 220 g，6~10周龄，体质量过轻将增加实验动物模型复制过程中的死亡率，体质量过重影响因素将增多，影响模型复制的稳定性。在性别选用上，应尽量选择雄性动物或雌雄各一半进行缺氧模型制作。有研究表示，雌性动物可分泌雌激素，而雌激素有显著的抗缺氧作用，降低模型复制的成功率[6-8]。此外，动物领回后须在平原环境适应性饲养1周，方可进行低压缺氧实验。

2.2.2 动物饲养 平原组和缺氧组大鼠均应在相同环境下饲养，温度为（22.0±3.5）℃，湿度为（50±10）%，明暗交替为12 h∶12 h，饲料、垫料经高压灭菌，饮水为冷开水。夏季须每天更换垫料，冬季每周更换3次，冬季还应注意保暖。饲养间应保持干燥、无嘈杂。环境温度、湿度等的不适均会导致大鼠心情烦躁易怒，影响模型复制的成功率。模型复制期间，所有进舱换水换料均不能降至平原环境进行，否则将引起动物缺氧-复氧-再缺氧循环，造成氧化应激损伤，导致模型复制的失败。低压舱环境密闭，需要经常观察动物情况，大鼠低压缺氧后，前7天内食量会显著下降，体质量降低，也是动物模型复制过程中死亡的高峰期，应重点观察，避免动物死亡后尸体的腐臭味影响环境。另外，还应重点保证饮水的供给。

2.3 动物取材注意事项 取材前大鼠需禁食12~18 h，时间过长会增加大鼠的死亡率，时间过短达不到禁食效果，此时还应给予充足的饮水。取材时，大鼠麻醉后进行插管，插管结束后，动物取材应尽快完成，夏季通常在动物死后4 h内完成，时间过长，组织容易变性、腐败，影响实验结果。冬季可适当延长取材时间。另外，所有操作均需在冰上进行。采血时需要将采血管适当上下颠倒混匀，以避免采血过程中发生凝血或溶血。

3 结 语

在教学或研究慢性高原病的发病机理及其防治对策时，建立一个理想的实验动物缺氧模型无疑具有极其重要的意义。理想的低压缺氧动物模型可用于高原环境所致的心、脑、肺[9-11]等相关疾病机理及防治的研究。理想的实验模型应具备重复性好、操作性强，特异性强等特点。细节往往是决定实验模型复制成功的关键因素，注重细节，选择模型复制的有利因素，规避模型复制的危害因素，可以很大程度上提高模型复制的成功率，也可使低压缺氧大鼠模型的复制更加稳定，对实践教学，甚至慢性高原病病因、发病机制等研究顺利进行起到积极作用。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2015.09.055

B

1009-5519（2015）09-1410-03

2015-01-27）

国家973计划项目（2012CB518201）；国家自然科学基金资助项目（81370150，30973446）；重庆市研究生教育教学改革研究项目（yjg143068）。

李晓栩（1985-），女，重庆荣昌人，实验师，硕士研究生，主要从事高原病等基础研究；E-mail：kangleshizhu@163.com。

官立彬（E-mail：libinguan84@163.com）。