人工关节假体周围感染的实验室检查

李程旭 综述，黄 伟 审校

(重庆医科大学附属第一医院骨科 400016)

·综述·

人工关节假体周围感染的实验室检查

李程旭 综述，黄 伟△审校

(重庆医科大学附属第一医院骨科 400016)

人工关节；假体和植入物；实验室技术和方法；假体周围感染进展

随着医学技术的发展，人工关节置换已成为重建关节功能的主要手段，这使不少关节疼痛及关节功能障碍的患者明显提高了生活质量，与此同时人工关节翻修手术也越来越多。人工关节翻修的原因主要有：无菌性松动、人工关节脱位、假体磨损、假体周围骨折、假体周围感染(prosthetic joint infection，PJI)等。无菌性松动及假体周围感染是人工关节翻修排在前2位的原因，其中PJI是人工关节置换术后最严重的并发症之一。据统计人工髋关节的感染率为0.3%～1.7%[1]，人工膝关节的感染率为0.8%～1.9%[1]，人工肩关节的感染率为0.7%，人工肘关节的感染率为3.0%[2-3]。虽然PJI发病率较低，但一旦发生将严重影响关节功能，降低患者的生活质量，常需再次手术及长时间的抗菌药物治疗，严重者需行关节融合甚至截肢而导致终生残疾，给患者带来极大的身心及经济压力。近年来对 PJI的研究越来越多，在实验室检测方面产生新的认识，出现新的检测方法。下面就PJI定义、致病菌及实验室检查进行综述。

1 PJI的定义及诊断

PJI的诊断一直是一种挑战，目前无任何一种检查可以做到绝对的准确，诊断无“金标准”可言[4]。PJI的诊断主要依靠临床表现、实验室检查及影像学检查等综合考虑。骨科界试图通过多种指标的组合定义PJI，由此提出了许多不同的定义[4]。2011年11月美国骨科感染学会提出了一个新的PJI定义，(1)存在与假体相通的窦道；(2)或受累人工关节的两处假体周围组织或关节液标本中分离出同一病原体；(3)或满足以下6条中的4条：①红细胞沉降率或C-反应蛋白(CRP)水平升高；②滑膜白细胞(WBC)数升高；③滑膜中性粒细胞百分比升高；④受累关节出现化脓表现；⑤假体周围组织或关节液标本中一次培养分离出微生物；⑥400倍放大率下，假体周围组织的病理学分析在5个高倍镜视野下发现大于5个中性粒细胞[5]。若满足第3种标准不少于4条，PJI可能存在。但是对于一些低毒性PJI，尽管有感染存在，却不能达到上述标准。

2 PJI的常见致病菌

PJI最常见的致病菌是金黄色葡萄球菌和凝血酶阴性葡萄球菌(约占50%)，其他有链球菌、革兰阴性杆菌、厌氧菌等。近年来一些少见的细菌如假单胞菌、绿脓杆菌、肠杆菌、及变形杆菌等呈逐渐增多的趋势[6]。真菌感染比较少见，一旦发生将造成灾难性后果。

3 PJI的实验室检查

3.1 血清学检查

3.1.1 血常规WBC计数 血液WBC计数升高曾经作为判定PJI的指标之一，然而在一些低毒性感染时血液WBC计数往往正常。Deirmengian等[7]的研究指出髋膝关节置换术后4 d内WBC计数一般都升高，术后血液WBC计数在预测PJI的敏感性为79.2%，而特异性却只有46.4%。可见血常规WBC计数并非诊断PJI的精确指标。

3.1.2 血清CRP和血沉(erythrocyte sedimentation rate，ESR) ESR及CRP是传统的血清学检测指标。ESR指RBC在一定条件下的沉降速率，主要受RBC自身的大小、形状及血浆成分、血流状态等影响。髋关节置换术后ESR升高，到5～7 d达峰值，后缓慢下降，于术后3个月时基本恢复正常或降至术前水平[8]。CRP是在炎症、感染、组织损伤等情况下由肝细胞产生的一种急性时相蛋白。有研究指出在髋关节置换术后CRP迅速升高，到2～3 d达峰值，后又迅速下降，2～3周后恢复到正常[8]。如术后3周后CRP升高提示PJI可能。髋关节置换术后血清CRP比ESR更快达到峰值可能提示它在术后预测PJI更加敏感。ESR、CRP的敏感性及特异性随着所选临界值的变化而变化。Ghanem等[9]提出通过受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)分析来协助确定ESR、CRP的临界值，从而有助于达到最佳的诊断敏感性及特异性平衡。ESR、CRP作为非特异性炎症指标，在风湿性疾病、痛风、全身性疾病或近期外科手术等情况时都可能升高，但由于其具有无创、简便、价廉及较高的灵敏度等优点，目前是临床工作中常用的PJI筛查工具。

3.1.3 血清降钙素原(procalcitonin，PCT)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF) PCT是近年来受到广泛推崇的诊断细菌感染的生化指标。它是一种糖蛋白，在生理情况下由甲状腺C细胞产生和分泌；在感染时单核细胞衍生的巨噬细胞可通过招募感染组织内的实质细胞(如脂肪细胞、肌细胞等)产生并释放大量的PCT[10]。它对全身性感染具有较高的敏感性与特异性，但PCT的产生与炎性反应的范围和程度有关。TNF是由单核细胞产生并释放的一种细胞因子。1项对78例关节翻修患者的回顾性研究指出，PCT>0.3 ng/mL为诊断标准时，诊断PJI的敏感性仅为33%，但特异性为98%；TNF-α>40 ng/mL为诊断标准时，诊断PJI的敏感性仅为43%，特异性为94%[11]。可见PCT及TNF-α对诊断PJI具有特异性高但敏感性低的特点，敏感性低可能与低毒性细菌感染不足以引起其大量释放有关，这说明单独的PCT及TNF-α不是良好的PJI检测指标。

3.1.4 IL-6 IL-6作为一项新的感染指标在临床上越来越受到重视。是机体受刺激后由单核-巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞等产生的一种多效细胞因子，它也是一种重要的炎症介质。Di Cesare等[12]指出血清IL-6于术后6～12 h达峰值，48～72 h即可迅速下降至术前正常水平。与ESR及CRP相比，IL-6术后能更快地上升并能更快地恢复至正常值，这提示它可能是一种更好的预测早期感染的指标。Bottner等[11]的研究表明以IL-6>12 pg/mL为诊断标准，其对PJI诊断的敏感性为95%，特异性为87%，阳性预测值为74%，阴性预测值为98%，准确性为89%。单用IL-6的诊断价值与CRP比较差异不大，但如将IL-6与CRP联合应用则对PJI具有更高的诊断价值。

3.1.5 病原体抗体检测 由于PJI的致病机制复杂，需要事先确定其中合适的抗原来检测相应的抗体，这为采用该方法检测PJI造成了困难。2011年一种新的金黄色葡萄球菌IgM抗体酶联免疫吸附测定技术被用于诊断PJI，在试验中采用0.35单位为诊断标准时，其对金黄色葡萄球菌感染诊断的敏感性及特异性分别为90%、95%，同时该技术还可用于评价抗菌方案的疗效[13]。

3.2 关节穿刺关节液检查 关节液标本的获得属于有创操作，而穿刺会增加关节感染以及感染扩散的风险，因而只有在通过筛查后高度怀疑PJI时才用。

3.2.1 关节液WBC计数和分类 前次手术后出现症状的时间会影响WBC计数和中性粒细胞比率的临界值[14]。目前尚无统一的关节液WBC计数及分类诊断标准。许多研究中以WBC计数大于1 100～4 000个/μL，中性粒细胞比率大于64%至80%为标准[15-16]。Chanem等[15]在对429例膝关节翻修病例的研究后指出，以WBC计数大于1 100个/μL及中性粒细胞比率大于64.0%为诊断标准时，得出对PJI诊断的敏感性为85.0%，特异性为99.2%，阳性预测值为98.6%，阴性预测值为91.6%。在检测前2～3周内使用了抗菌药物会影响到本项检测的结果。在临床工作中膝关节穿刺较容易，但髋关节穿刺比较困难而常需放射或超声引导，这些都影响了其应用。

3.2.2 关节液中细胞因子检测

3.2.2.1 滑膜CRP检测 滑膜CRP新近被认为是一种比血清CRP更可靠的诊断PJI的标志物，它能更直接地反应关节内感染状况。1项对66例全膝关节翻修患者的研究显示滑膜CRP对PJI诊断的敏感性为70%～84%，特异性为97%～100%；而血清CRP的敏感性及特异性分别为76%、93%[17]。Parvizi等[18]对63例人工关节翻修患者滑液标本的前瞻性研究中，通过ROC分析得到最佳的诊断敏感性及特异性平衡的滑膜CRP临界值为9.5 mg/L，此时其诊断PJI的敏感性及特异性分别为85%、95%，曲线下面积为0.92。

3.2.2.2 WBC酯酶检测 WBC酯酶是由招募到感染部位的中性粒细胞分泌的一种酶。Parvizi等[19]报道将108例膝关节翻修患者关节液滴到WBC酯酶检测条带上然后观察颜色变化，颜色变化(分级为-，+，++)与WBC酯酶水平相对应，将++定为阳性，其诊断PJI的敏感性为80.6%，特异性为100.0%，阳性预测值为100.0%，阴性预测值为93.3%。这也提供了一种快速、简便、便宜的PJI检测方法。

3.2.2.3 其他细胞因子 1项新近的研究对比了PJI与无菌性松动患者的关节液，发现β-防御素3(HBD-3)和抗菌肽LL-37显著升高，通过ROC分析，其曲线下面积分别是0.745和0.875。此外，显著增加的与感染有关的细胞因子还有IL-1β、IL-4、IL-6、IL-17A、干扰素(IFN)-γ和TNF-α。Logistic回归分析表明，抗菌肽与另一滑液标志物组合能提高诊断PJI的准确性。LL-37和IL-4组合，曲线下面积为0.916；LL-37和IL-6组合，曲线下面积为0.895；HBD-3和IL-4组合，曲线下面积为0.972；HBD-3和IL-6组合，曲线下面积为0.849[20]。另一项研究检测了74例患者关节液中46种不同的炎症标志物，通过ROC及蛋白组学分析，发现了5种有潜在诊断价值的蛋白，它们分别是血管内皮生长因子(VEGF)、CRP、α2-微球蛋白、IL-8、IL-6[21]。Deirmengian等[22]分析了23个潜在的滑液标志物，发现了6种有较高准确性的标志物，它们分别是IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-17、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、抗白细胞蛋白酶(SKALP)。

3.3 微生物检查

3.3.1 关节液涂片革兰染色 关节液涂片革兰染色诊断PJI的敏感性极低，还可能由于染料中细菌污染而造成假阳性，目前认为其对PJI的诊断意义不大。1项对921例膝关节翻修手术的研究指出，术中关节液涂片革兰染色对诊断PJI的敏感性只为27.0%，特异性为99.9%，阴性预测值为98.5%，阴性预测值为79.0%，准确性为80.0%[23]。

3.3.2 细菌培养 用作细菌培养的标本包括：外周血、关节液、假体周围组织及假体本身。细菌培养可因近期使用了抗菌药物、培养基不合适、标本送检时间过长、培养条件不合适、细菌量较少等原因出现假阴性结果。也可因采集及送检标本过程中的污染而出现假阳性结果。故在采集标本前应至少停用抗菌药物2～3周。在术中应至少采集假体周围3个不同部位标本送培养。术中见炎症程度低时，需采集更多样本送检。同时在标本采集及运送过程中应避免污染。浅表伤口或窦道口周围常受周围皮肤微生物污染，同时敏感性也低，故不应直接在该处采集标本。标本接种在培养基上并在不同的培养条件(需氧、5%二氧化碳和厌氧)下进行培养。Hughes等[24]前瞻性地将关节翻修术中采集的标本接种于4种培养基上进行比较，发现自动BACTEC血培养瓶及肉汤增菌培养基的敏感性最高，分别为87%和83%，厌氧培养基为57%，普通平板培养基为39%，所有4种培养方法均有高度的特异性(97%～100%)。细菌培养时间应为2～7 d，如怀疑为生长缓慢的微生物，则培养时间应延长至10 d[25]。细菌培养对PJI鉴别的敏感性较低，还因为PJI的致病微生物通常通过形成生物膜定植于假体表面，只有少量细菌从生物膜脱离。假体周围组织培养往往不能取到假体表面的微生物。利用一定频率的超声处理取下的假体，可碎裂细菌生物膜，将假体超声降解液进行培养可增加培养的成功率，此法对培养前已使用了抗菌药物的患者尤为重要[26]。2种培养方法比较后发现，假体超声降解液培养的敏感性及特异性分别为66.7%和98.0%；假体周围组织培养的敏感性及特异性分别为54.5%和95.1%[26]。

3.3.3 分子生物学技术

3.3.3.1 聚合酶链反应技术(PCR) PCR是通过检测细菌特异性核酸颗粒来诊断PJI，与普通细菌培养相比具有检测迅速且不受近期使用抗菌药物影响的特点。PCR技术的缺点是假阳性率较高，且无法作药敏试验。近年来一项以16SrRNA为PCR扩增靶分子的细菌快速分类鉴定技术出现。16SrRNA基因存在于所有细菌染色体基因中，有高度的保守性。一项前瞻性的研究证明用16SrRNA基因的PCR技术可明显提高诊断PJI的敏感性及特异性，与细菌培养相比16SPCR具有更高的特异性和阳性预测价值，即使对少量样本的检测中出现一个16SPCR阳性结果仍高度提示PJI[27]。最近有报道用基于rRNA的逆转录定量PCR(RT-qPCR)检测关节液，并与术中培养的结果进行比较，发现RT-qPCR检测的特异性和阳性预测值为100%，敏感性与培养的结果一致。在灭菌7 d后，RT-qPCR检测仍可探测到信号，这可用于检测已使用了抗菌药物的患者[28]。

3.3.3.2 荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH) FISH是根据已知微生物不同分类级别上种群特异的DNA序列，以利用荧光标记的特异寡聚核苷酸片段作为探针，与环境基因组中DNA中分子杂交，以检测该特异微生物的存在与丰度。该技术可在1 h内快速检测血培养中的致病菌[29]。

3.4 病理组织检查 病理组织检查标本通常采用穿刺组织、骨及假体周围组织。而在术中采假包膜或假体周围组织送快速冰冻切片是最常用的术中检测PJI方法，但结果会受到取材部位及病检医师经验的影响，且目前其判断标准尚未统一。有报道将每高倍镜视野下多型核细胞数大于或等于5个作为诊断标准，发现其敏感性及特异性分别为85%和87%[30]。此外也有报道，以每高倍镜视野下多型核细胞数大于或等于10个作为诊断标准，其敏感性及特异性分别为86%和85%[31]。Tsaras等[32]的1篇Meta分析报道指出术中假体周围组织冰冻切片能比较好地明确本身存在感染的病例，但在排除感染方面的准确性较差。该文还指出运用最多的2个临界值即每高倍镜视野下大于或等于5或10个多型核细胞在诊断PJI的准确性上差异无统计学意义(P>0.05)。

4 小结

目前对PJI的诊断没有任何一种检查能够做到绝对的准确无误。近年来，实验室检查在诊断PJI方面发展很快，取得了初步成果。在血清及关节液中发现了一些与诊断PJI有关的新的标志物；出现了超声裂解处理假体及自动BACTCE血培养瓶等培养新方法；以PCR和FISH为代表的分子生物学技术的快速发展等，这些成果都在为诊断PJI提供新的方法和思路。这些新的方法和思路还需要在临床工作中进一步的验证和改进。

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李程旭(1974-)，在读硕士，主要从事关节外科的研究。△

,Tel:13883383330;E-mail：huangwei68@263.net。

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.03.048

R446.9

A

1671-8348(2015)03-0414-04

2014-08-02

2014-10-01)